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小麦全蚀病生防内生细菌及其抗菌活性物质的研究

刘冰  
【摘要】: 由禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx Olier var. tritici Walker(简称Ggt)引起的小麦全蚀病是小麦上的毁灭性病害之一,对农业生产造成了严重损失。由于缺乏抗性品种和有效、经济的化学药剂,而且轮作倒茬在小麦大面积种植地区受到了很大的限制,因此,生物防治成为防治小麦全蚀病的主要措施。然而,外界恶劣环境使许多生防菌剂效果不够稳定,因此筛选受环境因素影响小的生防因子是该病生物防治的关键。内生细菌具有生活在植物体内的独特优势,近几年在植物病害生物防治方面受到越来越多的重视,因此本研究通过温室盆栽试验从本实验室分离保存的小麦内生细菌中筛选出5株对小麦全蚀病具有良好防效的菌株,并对其中的EDR4菌株及其活性成份、防病效果以及细胞学机理进行了较为系统的研究,主要取得了以下结果: (1)在人工接种小麦全蚀病菌后,通过多批次温室盆栽幼苗试验从27株小麦内生细菌中筛选出5株防病效果较好且稳定的菌株,防效最高可达到57.3%,较对照药剂多菌灵防效高16.8%。进一步应用其发酵滤液、菌悬液的抑菌试验结果发现,5株生防细菌对全蚀病菌的菌丝生长均有明显的抑制作用,但各菌株的发酵滤液和菌悬液抑菌效果有明显差异,说明这些内生细菌的防病机理不尽相同。 (2)通过三种方法施用EDR4利福平突变菌株,发现发酵原液灌根处理时定殖在小麦体内的平均菌体数量最多(23.54×103 cfu/g鲜组织),叶面喷施次之,浸种处理最少(1.97×103 cfu/g鲜组织),但在处理后一个月小麦体内平均的菌体定殖数量均有所下降。灌根处理有利于细菌在根组织定殖,十天后约为16.90×103 cfu/g鲜组织,在处理后一个月内呈增加趋势,而稀释2倍后发酵液灌根处理时根组织定殖的菌体数量明显少于原液。叶面喷施则有利于叶部定殖(22.59×103 cfu/g鲜组织),说明不同使用方法、不同稀释度对生防细菌在小麦体内不同组织部位的定殖均有很大影响。 (3)连续2年的田间小区防治试验结果表明,播种时沟施EDR4菌株,发现其对小麦全蚀病的防治效果在拔节期可达35~50%,并且对小麦生长发育、产量形成有促进作用。 (4)通过培养特性、形态学和生理生化特征以及16S rDNA序列分析将EDR4菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。皿内抑菌试验发现EDR4菌株的抑菌谱较广,对12种常见植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。 (5)对EDR4菌株活性物质的研究发现,其发酵滤液经过硫酸铵盐析和浓缩,其30%饱和度盐析物和30%~70%饱和度盐析物均有明显的抑菌活性,活性检测结果表明主要抗菌物质为蛋白类。进一步的摇瓶发酵条件优化结果表明,3mL EDR4菌株种子液接入装有50mL初始pH值为7的LB培养液中(250mL三角瓶),28℃下150rpm培养48h,细菌生长量、蛋白总量以及抗菌蛋白的抑菌效果都可达到最佳。 (6)通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析和聚丙烯凝胶电泳等方法从EDR4菌株发酵滤液中纯化出了抗菌蛋白E2,检测发现其分子量约377kDa,pI值6.59,无蛋白酶抑制活性和β-1, 3葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶活性,但具有核糖核酸酶和凝血活性以及弱蛋白酶活性。比较发现E2蛋白性质与已知抗菌蛋白有很大差异,Q-TOF2质谱测序鉴定其为新蛋白,其对小麦全蚀病菌及其他6种常见植物病原真菌均有抑制作用。 (7)光学和扫描电子显微镜观察结果发现,EDR4菌株处理小麦全蚀病菌后3d~5d,菌落生长受到抑制,菌丝消解,内含物渗出,顶端膨大甚至死亡。透射电镜观察发现EDR4菌体出现在小麦根部组织内并且使病原菌细胞发生畸变,并且可诱导寄主细胞壁加厚和形成乳突等防卫反应,延缓病原菌扩展。 (8)扫描和透射电子显微镜观察发现,EDR4菌株的E2蛋白可引起小麦全蚀病菌菌丝顶端膨大、菌丝干瘪、细胞内含物外渗、细胞壁加厚,细胞内形成新细胞壁、细胞质和细胞器降解等现象。 以上结果可为该菌株及其抗菌蛋白的开发应用提供物质基础,并为进一步研究其抗菌机理奠定了理论基础。


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