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雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究

李琰  
【摘要】: 雷公藤是一种重要的杀虫植物和传统的中药材,近年来在医用和农用无公害新型杀虫剂等方面的需求不断增加,使野生雷公藤资源盲目的开采利用而急剧减少。为保护雷公藤自然资源,维护生态环境,实现雷公藤资源可持续利用发展和满足人们的需求,通过组织培养的方式来生产雷公藤的有用次生代谢产物,具有重要的实际应用价值。本研究以雷公藤一年生枝条扦插形成的根、茎、叶为外植体诱导愈伤组织,经多次继代培养后选择疏松型愈伤组织建立悬浮细胞系和不定根培养体系,探讨外植体、培养基各种成分、培养条件、前体物质、诱导子等对悬浮细胞、不定根的生长和雷公藤内酯醇及生物碱含量的影响。主要研究结果如下: 1.雷公藤愈伤组织诱导及培养条件优化 雷公藤的外植体种类、基本培养基类型、激素浓度及组合对愈伤组织诱导有显著的影响。根、茎、叶3种外植体均可诱导出愈伤组织,6种基本培养基中MS诱导率最高;单独添加2,4-D时以1.0 mg/L诱导率最高,为47.37%;单独添加NAA时以2.0 mg/L诱导率最高,为36.32%,生长素与细胞分裂素KT或6-BA的配合使用时明显提高出愈率,最佳培养基及激素组合为MS+1.0 mg/L 2,4-D +0.5~1.0 mg/L KT,愈伤组织诱导在90%以上。 以3种不同来源的愈伤组织进行继代培养,研究愈伤组织生长与内酯醇及生物碱积累的关系,探讨基本培养基类型、激素浓度及组合、预防褐变等对愈伤组织生长及对内酯醇和生物碱含量的影响。结果表明,在连续继代多次后,根愈伤组织逐渐变的疏松、颗粒状,而茎、叶愈伤组织致密、呈块状,褐化严重。根愈伤组织增长量、内酯醇含量也明显高于茎、叶愈伤组织,而叶愈伤组织中生物碱的含量明显高于根、茎愈伤组织中的含量;7种基本培养基中6,7-V的愈伤组织增长量最大,White培养基有利于内酯醇和生物碱的积累,但愈伤组织增长量较低;不同浓度2,4-D、NAA及与KT、6-BA组合表明,1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT明显促进愈伤组织生长和生物碱的形成,而4.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于愈伤组织中内酯醇的合成;培养基中加入5~10 mg/LAgNO3,不仅能明显抑制愈伤组织褐变,也明显提高内酯醇含量。暗光培养的愈伤组织增长量、内酯醇及总生物碱含量均较高,且褐化程度较轻。培养到第50天愈伤组织增长量达到最大值,第55天时内酯醇含量达到最大值,生物碱含量随着培养时间的延长而升高。 2.雷公藤悬浮培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响 以根愈伤组织建立了悬浮系,研究基本培养基类型、继代时间、接种密度、pH值和添加7种氨基酸、10种非生物诱导子和7种前体物质对细胞的生长和内酯醇和生物碱含量的影响。悬浮细胞在NT培养基的增长量最高,MS适合进一步继代培养,在White培养基上内酯醇和总生物碱的含量最高;最佳接种密度为8~12 g/L,最适继代时间为30~35 d,培养55天时收获细胞。培养液pH值为5.8时,细胞增长量最大,内酯醇在pH值为6.4时最高,pH值为5.2时总生物碱最高。 培养基中天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和丝氨酸的加入明显抑制雷公藤细胞的生长,且浓度越大抑制作用越强;加入苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等在低浓度时能促进细胞的生长。7种氨基酸均能不同程度的促进内酯醇的合成,其中精氨酸1mmol/L和半胱氨酸2 mmol/L时,内酯醇含量较对照提高了3.2倍和2.8倍。除半胱氨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他氨基酸的加入对雷公藤生物碱的合成均起不同程度的促进作用,其中蛋氨酸0.5 mmol/L时,雷公藤不仅生物碱含量较对照提高了1.5倍,内酯醇含量也较对照提高了2.3倍。 非生物诱导子中,大豆蛋白、水杨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、酸水解干酪素和甲醛抑制细胞的生长,矮壮素、乙酸钠、酵母提取物和苯甲酸钠在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除酸水解干酪素抑制内酯醇的合成以外,其他均对内酯醇的合成起促进作用,其中谷氨酰胺2 mmol/L和大豆蛋白1 g/L时,内酯醇含量较对照提高了2.4倍和2.9倍。除水杨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他诱导子的加入对雷公藤生物碱的合成均起促进作用,其中酵母提取物2 g/L时,雷公藤生物碱含量较对照提高了1.3倍。甲醛浓度为1.0 mL/L时,虽然细胞增长量仅为对照的77%,但内酯醇含量为对照的2倍,总生物碱含量为对照的1.2倍。 前体物质中,除桂皮酸对雷公藤细胞的生长起抑制作用外,其他前体物质在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除丙二酸抑制内酯醇的合成以外,其他前体物均对内酯醇的合成起促进作用,其中桂皮酸10 mg/L时,较对照提高了2倍;异戊二烯10 mL/L内酯醇为对照的2.5倍,总生物碱含量为对照的1.5倍,而细胞的增长量下降并不明显,为对照的96%。柠檬酸、桂皮酸和丙酮酸对雷公藤生物碱的合成起抑制作用,丙二酸、苹果酸和酒石酸在低浓度时对雷公藤生物碱的合成起促进作用,其中丙二酸浓度为2.0 mmol/L细胞内总生物碱含量为对照的2倍。 3.雷公藤不定根培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以悬浮细胞诱导不定根,建立不定根摇瓶培养体系,研究培养液中营养元素的消耗规律,探讨大量元素、微量元素、碳源及有机物和生物诱导子等对不定根生长和内酯醇及生物碱含量的影响。在悬浮细胞中,加入4.0 mg/L NAA,可诱导产生不定根,经过多代培养,形成了稳定的雷公藤不定根培养体系,检测不定根中内酯醇含量为悬浮细胞的2.1倍,为根皮粉中的4.5倍。 经对NT培养基中大量元素的消耗动态研究,不定根进入快速生长期后,氮、磷、钾元素含量明显不足导致生长进入停滞期;当NO3-/NH4+与NT培养基一致并维持不变时,随着培养基中氮浓度的提高,雷公藤不定根增长量急剧上升,当总氮浓度为50 mmol/L时,增长量达到最大值。当总氮浓度为30 mmol/L时,内酯醇和总生物碱含量达最大值。在NO3-/NH4+为9︰1时,不定根增长量最大,内酯醇含量与NT培养基氮源比例基本一致时最高;只有铵态氮的情况下,不定根中总生物碱的含量为最高。不定根增长量随着PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度的升高而升高;内酯醇含量在K+浓度为NT培养基的1.3倍时,Ca~(2+)浓度为NT培养基的2/3时,达到最大值,内酯醇含量随着PO43-浓度的升高而升高,NT培养基中Mg~(2+)浓度即可使内酯醇含量达到最大值;NT培养基中PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度即可使总生物碱含量达到最大值。 微量元素中,NT培养基中Fe~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)即可满足雷公藤不定根的生长,2倍Mn~(2+)浓度可使雷公藤不定根的生长量达最大值,在试验范围内,Na2MoO4浓度越高不定根增长量越高,培养基中缺乏H3BO3、KI和CoCI2不影响雷公藤不定根的生长;Fe~(2+)浓度为正常标准的1/3时,内酯醇和总生物碱的积累达到最大值;在试验范围内内酯醇和总生物碱的含量随Mn~(2+)浓度的升高而升高;Zn~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇的积累达到最大值,而生物碱的积累在该试验范围内随着Zn~(2+)盐浓度的升高而升高;Cu~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇和生物碱的积累达到最大值;H3BO3的加入对内酯醇及总生物碱的合成起抑制作用,浓度越高抑制作用越强;培养基中缺乏KI时不影响生物碱的合成,内酯醇的含量随着KI浓度的升高而升高;培养基中缺乏CoCI2并不影响内酯醇的合成,在NT培养基正常标准的2倍时,生物碱的含量最高;培养基中缺乏Na2MoO4有利于不定根中内酯醇和生物碱的合成,不定根中内酯醇和生物碱的含量随着鉬酸钠浓度的升高而降低。 碳源中,适合不定根生长、内酯醇形成的碳源为蔗糖,适合生物碱积累的碳源为葡萄糖;适合雷公藤不定根生长的蔗糖浓度为45 g/L,不定根中内酯醇和生物碱含量在蔗糖浓度为20 g/L时最高。7种有机物中,NT培养基中的正常标准的肌醇和VB1,即可使雷公藤不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。加入0.5 mg/L的烟酸可使内酯醇的含量达到最大值,但烟酸的加入对不定根中生物碱的合成明显的抑制作用,且浓度越高抑制作用越强。当VB6浓度为1mg/L,不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。在试验范围内,不定根增长量、内酯醇含量随着甘氨酸浓度的增加而升高,生物碱含量在甘氨酸浓度为1 mg/L时,达到最大值。叶酸和生物素的加入并不影响雷公藤不定根的生长,但在叶酸浓度为1 mg/L时,可使内酯醇及生物碱的含量达到最大值。生物素在0.5 mg/L时,内酯醇含量达到最大值,在1 mg/L时,生物碱的含量达到最大值。 采用7种生物诱导子分别处理雷公藤不定根,均能促进不定根中内酯醇和生物碱的合成,并且对不定根的生长均没有明显影响,其中链霉菌和苹果炭疽病菌效果最好。经苹果炭疽病菌处理的雷公藤不定根中内酯醇的含量达88.65μg/gDW,为对照(39.62μg/gDW)的2.2倍,生物碱含量达6.09 mg/g DW,为对照(3.02 mg/gDW)的2倍。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及不定根的生长状态有关。对苹果炭疽病菌来说,诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖100μg/mL;不定根在对数生长末期对诱导作用最敏感;在加入诱导子15 d后收获不定根,不定根中的内酯醇含量最高,而生物碱含量随诱导子作用时间的延长而提高。 在不同体积的三角瓶中,按三角瓶体积的2/5加入培养液,随着三角瓶体积的增大,雷公藤不定根增长量略有下降, 1 L和5 L的三角瓶中不定根增长量分别下降2.92%和6.57%,而不定根和培养液中的内酯醇及生物碱含量差异不明显。内酯醇和生物碱均为分泌型,在过滤不定根后的培养液中内酯醇占每瓶内酯醇总量的56%,总生物碱占每瓶总量的65%。 4.雷公藤组培产物有效成分含量测定及杀虫活性研究 建立了在同一提取物中同时测定雷公藤内酯醇和总生物碱的方法。内酯醇的检测范围为1~100μg/ mL,(R2= 0.9999);雷公藤总生物碱在5-100μg/ mL范围内线性关系较好(R2= 0.9998);在同一提取液中,雷公藤内酯醇和总生物碱的加样回收率分别为100.72%(RSD=0.975%)、100.33%(RSD=2.56%)。不同组织培养产物提取液对3龄小菜蛾的生长均有明显的抑制和毒杀作用,其中不定根培养物提取物处理后每天的小菜蛾体重增加量均成了负值,72 h后70%左右已经死亡,存活的试虫体重比试验前下降了18.33%。 5.雷公藤再生体系建立及组培快繁研究 以雷公藤胚性愈伤组织为材料,研究了体细胞胚的发生过程和植株再生、芽苗增殖的影响因素。组织学观察表明,雷公藤体细胞胚起源于愈伤组织内部的单细胞,发育历程与合子胚相似。在愈伤组织再生中,NAA较2,4-D效果好, 6-BA优于KT,NAA与6-BA配合使用明显提高再生率。6种培养基中,MS和B5的愈伤组织再生率达100%,在0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,不仅愈伤组织再生率达100%,而且每块愈伤组织平均形成芽数也比较多。胚性愈伤组织在继代培养过程中,植株再生率和愈伤组织分化形成的小苗数,经历了一个由低到高再到低的过程。以继代八个月到一年之间的胚性愈伤组织的再生能力最强,达100%。雷公藤胚性愈伤组织在继代20个月后已经丧失分化能力。再生苗茎段增殖以1/2MS+2.0 mg/L IBA为好,生根培养以1/2MS+2.0 mg/L IBA+0.5 g/L活性炭较好,生根率达100%。移栽至珍珠岩与腐殖质土(1︰1)的混合基质中成活率达96%。


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