收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究

赵清梅  
【摘要】: 各种角膜疾病和外科损伤都会导致角膜细胞受损,当损伤超过其生理代偿时,就会发生角膜病变,严重时会导致角膜盲。目前角膜移植是治疗此类角膜疾病比较成熟的方法,但受到了供体角膜缺乏、术后并发症、角膜供体老龄化等条件的限制。将自体或异体角膜细胞体外培养构建组织工程化人工角膜移植,既可解决临床应用供体短缺问题,又可为角膜体外药理或生理研究提供大量材料。本研究通过体外分离培养山羊角膜上皮细胞和角膜内皮细胞,并研究其体外生长特性和接种羊膜载体培养情况,为组织工程人工角膜的构建奠定理论基础。 1.山羊角膜上皮细胞的体外分离培养与鉴定 通过比较组织块和酶消化法培养山羊原代角膜缘上皮细胞,发现酶消化法更适合原代角膜缘上皮细胞的分离纯化培养。获取的山羊角膜缘上皮细胞形态为多角形,具有较强的增殖能力,体外培养能传20多代,细胞冻存后仍具有细胞冻存前的形态和活力。经免疫组化和RT-PCR检测,培养的角膜缘上皮细胞表达K3/K12、p63、Cx43、ABCG2和PCNA,具有角膜上皮细胞和角膜缘干细胞表型,说明分离培养的细胞为角膜缘上皮细胞和角膜缘干细胞混合物,可为组织工程化人工角膜上皮的构建提供种子细胞。 2.组织工程化人工角膜上皮的构建 在去上皮细胞人羊膜上接种关中奶山羊角膜缘组织块或培养的关中奶山羊角膜缘上皮细胞构建的组织工程角膜上皮,并对其进行组织形态学、超微结构观察和免疫组化检测。结果显示,角膜缘组织块和角膜上皮细胞在羊膜上培养15 d均可形成6~7层结构,细胞内含丰富的细胞器和糖原颗粒,细胞间有大量的桥粒连接,细胞与羊膜间形成半桥粒连接,构建的复合角膜上皮p63染色阳性。比较角膜缘组织块在去羊膜上皮细胞的新鲜羊膜、冻存30 d羊膜、冻存60 d羊膜和冻存180 d羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在冻存30 d羊膜上最大,而在新鲜羊膜上细胞生长面积最小。比较角膜缘组织块在冻存60 d去上皮羊膜和未去上皮羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在去上皮羊膜上显著大于未去上皮羊膜上。说明用组织块法和种传代细胞法均能构建组织工程化人工角膜上皮,细胞培养载体需用冻存30 d左右去上皮细胞的羊膜,为组织工程化人工角膜上皮的构建研究奠定理论基础。 3.山羊角膜内皮细胞的体外分离培养与鉴定 比较组织块法、胰酶消化法、dispase酶消化法和dispase酶+胰酶消化法培养山羊原代角膜内皮细胞。dispase酶+胰酶消化法为角膜内皮细胞原代分离纯化的最适方法,分离的细胞在体外能连续传20多代,细胞冻存后解冻培养能保持冻存前细胞形态和活力。培养的细胞经扫描电镜和透射电镜观察,具有正常角膜内皮细胞特征,免疫组化染色和RT-PCR检测角膜内皮细胞表达神经元标志NSE和β3-tublin、星形胶质细胞标志GFAP、细胞间连接蛋白ZO-1和Cx43,不表达神经干细胞标志物Nestin、角膜缘干细胞标志p63和角膜上皮细胞标志K3/K12。比较细胞培养板包被物对角膜内皮细胞贴壁和增殖能力影响发现,Ⅳ胶原、多聚赖氨酸和明胶均能明显促进细胞贴壁和增殖,Ⅳ胶原和明胶组强于多聚赖氨酸组,而Ⅳ胶原组和明胶组之间差异不显著,提示可选择价格便宜的明胶作为细胞培养板用包被物。角膜内皮细胞培养液筛选发现:与NBS相比,FBS能更好的促进角膜内皮细胞增殖和维持其形态;培养液中添加bFGF能显著促进细胞增殖,但能促进细胞形态向成纤维形转变;添加EGF对细胞增殖影响不大,但能促进细胞形态改变;添加硫酸软骨素显著抑制细胞增殖,但能较好的维持细胞形态;添加Vc对细胞增殖和形态均无明显影响。将传代培养的角膜内皮细胞种羊膜上培养,经组织切片、透射和扫描电镜观察发现细胞在羊膜上具有形成单层的能力。说明分离培养的角膜内皮细胞具有正常角膜内皮细胞特征,能体外传代培养,在羊膜载体上具有形成单层的能力,可为构建组织工程化人工角膜内皮和角膜内皮细胞的体外实验研究提供种子细胞。 4.山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染 将人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入培养至7代的角膜内皮细胞内,通过免疫组化和RT-PCR检测证明转染的hTERT在山羊角膜内皮细胞内表达。通过传代培养观察,转染hTERT的角膜内皮细胞体外能传20多代,与未转染hTERT的角膜内皮细胞相比,并未显著提高其增殖能力。说明将人端粒酶基因转入山羊角膜内皮细胞内,未能明显延长细胞寿命。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王杏龙,Wolfgang Holtz;抑制素免疫山羊卵巢对外源性促性腺激素的反应[J];河北畜牧兽医;2003年05期
2 李育良,田九畴,庄志业,陈树林;山羊感觉和交感神经节中的肽类免疫反应结构[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);1993年04期
3 贾永红,史宪伟,简承松,朱文适,张亚平,何正权,廖正录,余应淮,李通权;贵州四个山羊品种mtDNA多态性及起源分化[J];动物学研究;1999年02期
4 李祥龙,张亚平,陈圣偶,曾凡同,邱祥聘,刘相模;山羊mtDNA多态性及其起源分化研究[J];畜牧兽医学报;1999年04期
5 陈龙,王丙云,毛鑫智,Award Daugsehies;山羊感染肝片吸虫后血浆肿瘤坏死因子-α和花生四烯酸代谢物动态变化初探[J];中国兽医寄生虫病;2000年04期
6 杨文华,明月;我国北方地区养羊业发展的对策与思考[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2004年04期
7 曹斌云,李键,王建辰,朱建楚,康靖全;IGF-Ⅰ对山羊睾丸间质细胞分泌睾酮的调节机理[J];中国兽医学报;1998年03期
8 吴忠良,范嵋君,赵克强,曹义宝;抑制素主动免疫对山羊繁殖率的影响[J];畜牧兽医杂志;1999年04期
9 冯振卿,李玉华,仇镇宁,李祥瑞,许立新,管晓虹;抗独特型单抗NP30抗山羊血吸虫病的免疫研究[J];上海免疫学杂志;2001年02期
10 程建国,霍义福,李红霞,敖特根花,哈斯阿古拉;内蒙古山羊流产病毒的特性研究[J];中国预防兽医学报;2001年06期
11 沈永林,张洪英,刘家国,李祥瑞,毛鑫智;山羊和水牛感染肝片吸虫后的细胞免疫研究[J];上海交通大学学报(农业科学版);2001年01期
12 王珂 ,裴国献 ,陈滨 ,金丹 ,魏宽海;用组织工程方法修复山羊胫骨骨缺损的实验研究[J];解放军医学杂志;2002年06期
13 王强,陈美珏,任兆瑞,黄淑帧,曾溢滔;山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2003年01期
14 成国祥,王捍东,成勇,吴维芬,穆宗尧,李国忠;用Digoxigenin标记DNA探针作基因转移山羊的整合检测[J];生物技术;1992年04期
15 成勇,徐少甫,劳为德,成国祥,张旭晨,王杏龙,张靖溥,陈建泉,魏允影;牛αs1酪蛋白/HBsAg基因在山羊乳腺中暂态表达[J];扬州大学学报(自然科学版);1998年03期
16 谷海刚,贺琪,李朝辉,姜威锋,张大弓,司文章,王树兴;山羊脾被膜的淋巴流向[J];新乡医学院学报;2000年04期
17 ;IQ大拼盘[J];青少年科学探索;2007年02期
18 ;新西兰雌雄同体山羊可望产生“人类乳汁”[J];中国家禽;2011年13期
19 刘化冬;;新西兰雌雄同体山羊可望产生“人类乳汁”[J];江西饲料;2011年04期
20 成勇,王玉阁,罗金平,沈玉,杨跃飞,鞠辉明,邹贤刚,徐少甫,劳为德,杜淼;由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊[J];生物工程学报;2002年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 钱丽丽;贾青;李雪梅;;山羊高繁殖力候选基因骨形态发生蛋白受体IB的多态性分析[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2010年
2 沈祖楠;李祥龙;周荣艳;李兰会;;山羊CLPG基因细胞遗传学定位及其变异分析[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
3 马章全;陈小强;;对我国毛皮用绵、山羊产业发展的思考[A];2010中国羊业进展[C];2010年
4 李月勤;侯玉晶;雷治海;苏娟;李珣;蔻芮;刘延鹏;;山羊Neuromedin S及其受体基因的克隆和mRNA在组织器官的表达[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
5 袁天杰;张诺;李树静;;孕酮在山羊超排中的作用分析[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
6 潘淑芳;韦英益;;山羊传染性脓疱病的防治[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C];2007年
7 柏冬星;于瑞奎;刘艳玲;张瑞姿;孙镇平;任颖;姚娟英;张阳军;杨盛荣;;大蒜氧化物对山羊内源性激素水平的影响[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
8 贾富勃;刘衍芬;柳志余;;山羊肠毒血症的诊治[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C];2007年
9 赵永聚;孙新明;何鹏;赵伟;魏泓;;不同胎次的母羊超数排卵处理效果的比较[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2005年
10 李引乾;梅雪洁;庞利娜;黄冻;张海亮;黄勇旗;;麻保沙星在山羊体内的药物动力学研究[A];中国畜牧兽医学会动物毒物学分会2009年学术研讨会论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵清梅;山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究[D];西北农林科技大学;2008年
2 黄冬维;山羊繁殖季节性调控通路相关基因的克隆、多态与表达研究[D];中国农业科学院;2012年
3 单兆亮;山羊心房颤动在由阵发性转为持续性过程中电生理改变的分析[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
4 杜园园;结膜上皮细胞在角膜基质中诱导转化为角膜上皮样细胞的研究[D];吉林大学;2007年
5 胡伟莲;皂甙对瘤胃发酵与甲烷产量及动物生产性能影响的研究[D];浙江大学;2005年
6 李利;山羊促卵泡素和促黄体素基因部分序列的研究[D];四川农业大学;2005年
7 闵令江;山羊肉用性能候选基因遗传分析及生长发育性状QTL定位[D];西北农林科技大学;2005年
8 田海滨;小鼠和山羊胚胎干细胞建系及其分化为神经元细胞的基础研究[D];山东大学;2005年
9 史明艳;山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究[D];西北农林科技大学;2006年
10 谷树严;以纤维蛋白为基质网架的组织工程角膜上皮的构建及移植实验研究[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李娜;自体喙突移植重建下颌髁状突的实验研究[D];四川大学;2005年
2 孙苏军;7,12-二甲基苯蒽(DMBA)体外诱导山羊乳腺上皮细胞的转化[D];西北农林科技大学;2005年
3 芦赟;山羊弓形虫代谢分泌抗原免疫应答研究[D];甘肃农业大学;2009年
4 刘谢荣;山羊胚胎分割试验研究[D];四川农业大学;2005年
5 康峰;催乳素受体基因单核苷酸多态性与山羊繁殖性能的相关研究[D];河北农业大学;2006年
6 王文亭;影响山羊胚胎细胞核移植效果主要因素的研究[D];河北农业大学;2006年
7 范晶鑫;多拉菌素明胶微球的制备及其在山羊体内药动学研究[D];东北农业大学;2008年
8 鲁进;山羊卵母细胞体外成熟及核移植研究[D];西北农林科技大学;2005年
9 韩雅婷;Nanog基因转染表皮干细胞及对其生物学特性影响的研究[D];西北农林科技大学;2006年
10 张建涛;山羊腹腔镜脾脏切除术及其对机体生理机能的影响[D];东北农业大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李萍;不要忽视发票的凭证作用[N];大庆日报;2010年
2 白云;从熟羊肉价格看养殖山羊的商机[N];中国畜牧兽医报;2009年
3 程优优;怎样减少山羊难产发生率[N];山西科技报;2009年
4 李济生 刘太兴;云阳:“借羊还羊”借出山羊满山坡[N];中国畜牧兽医报;2009年
5 杜玉兰;初夏山羊增奶五措施[N];山东科技报;2009年
6 记者 崔璀 通讯员 张钦炜;盼了多年的脱贫梦终于实现了[N];丽水日报;2009年
7 翟广华;秋冬时节 山羊管护技巧[N];山西科技报;2009年
8 周密;山羊可能感染了肺炎链球菌病[N];江苏农业科技报;2010年
9 郭姿麟;测定山羊体重和体尺的方法[N];中国畜牧兽医报;2009年
10 高贵涛;冬季饲喂山羊面面观[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978