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淇河鲫肌肉营养成分分析及生长激素基因cDNA克隆和表达的研究

高春生  
【摘要】: 淇河鲫(Carassius auratus gibelio var)原产于河南省淇河,以生长快、味道美和效益高等优点而久负盛名,河南省人民政府已正式行文将其列入《河南省重点保护野生动物名录》并以第一名予以公布。为了繁荣市场,丰富人民生活,发展池塘养殖已变得日益迫切,对淇河鲫的生物学特性、生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。而动物的生长和发育受多种因素的调节和控制,包括遗传,营养,环境和内分泌等。在内分泌系统中,生长激素(GH)占据着中心调节作用的位置,它是由脑垂体间叶细胞分泌的一种多肽激素,具有调节生长发育,参与体内代谢调节,增进食欲,提高食物转化率等作用,然而垂体中GH含量极低,分离纯化比较困难,使得GH生理功能的进一步研究和应用受到限制。随着现代生物技术的发展,已有研究表明基因重组的GH与天然的GH一样具有生物活性,基因重组GH应用于研究和生产已经成为可能。因此,我们以淇河鲫作为研究对象,通过含肉率测定、肌肉生化成分分析,对其品质、营养价值作出初步评定,为淇河鲫营养生理的研究提供理论基础;用RT-PCR和RACE技术从淇河鲫垂体总RNA中扩增获得了淇河鲫GH全长cDNA序列,并对核苷酸和氨基酸序列进行了分析,构建了淇河鲫GH基因的原核和真核表达载体,获得了相应的重组基因工程菌,并对基因工程菌进行了诱导表达研究,为下一步开展淇河鲫GH的生物活性检测、转基因鱼研究以及研制开发成为安全、高效的新型调节鱼类生长的基因制剂奠定坚实的基础。主要结果如下: 1)淇河鲫肌肉营养成分分析及营养价值评定 淇河鲫是含肉率(65.72%)较高的鱼类;肌肉水分、蛋白质、脂肪、灰分含量分别为75.56%、19.39%、2.96%、1.17%;氨基酸分析表明,淇河鲫肌肉氨基酸总量(18.22%)、必需氨基酸量(7.37%)均较高,必需氨基酸占氨基酸总量的百分比(40.45%)和必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(0.68)均符合WHO/FAO提出的40%左右和在0.60以上的要求,而且必需氨基酸含量高于婴儿需要量为底限的WHO/FAO评分模式;尤其是赖氨酸含量较丰富,达到鸡蛋蛋白质评分模式标准,较WHO/FAO评分模式高出30.0%,可以认为淇河鲫是一种营养丰富的优质鱼。 2)克隆并获得了淇河鲫GH全长cDNA序列 淇河鲫GH cDNA序列全长1191 bp,其中含Poly(A) 14 bp, 5’端非编码区长55 bp (含有在真核生物中高度保守的Kozak序列),阅读框长633 bp,3’端非编码区长503bp(含真核生物mRNA前体3’剪切和加poly(A)尾的信号ATTAAA序列),共编码210个氨基酸;编码的蛋白的分子量为23.78 ku。蛋白质结构分析表明淇河鲫GH信号肽为前22个氨基酸,成熟肽为188个氨基酸,成熟肽中有四个半胱氨酸(C),形成两个二硫键,对GH的正常折叠、维持空间结构以发挥有效的生理功能有着重要作用。 3)分析并揭示了淇河鲫GH基因结构和脊椎动物进化的关系 通过对不同分类地位脊椎动物GH基因的核苷酸序列和氨基酸序列深入分析发现:①GH家族有三个非常保守的区域,以淇河鲫GH氨基酸序号为标准,第28位到第44位、第70位到第111位、第180位到第210位;特别是从第180位到第210位这个区域高度保守,含有的非极性氨基酸达10个(其中3个半胱氨酸),为分子的疏水区,与GH分子的结构及稳定性有关;此外,除去信号肽部分,有30个氨基酸在所比较的动物中完全相同,可以认为这30个氨基酸残基对GH专一性、生物活性及空间构象有重要的作用。②成熟的GH是从一个共同的祖先进化而来,随着生物的进化过程,GH趋异进化成不同物种的GH分子;淇河鲫和鲤形目鱼类GH分歧较早,鲶形目鱼类的GH分歧次之,鲑鳟鱼类的GH分歧较晚,两栖类、禽类和哺乳类动物GH分歧最晚。 4)构建了淇河鲫GH基因的原核表达载体并获得了重组蛋白本研究在原核表达载体pQE30上成功插入了淇河鲫GH基因,成功构建获得了pQE30-GH原核表达载体,通过测序验证构建的表达载体结构和序列正确无误。该载体经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测在约24 ku处获得了表达产物,经薄层扫描分析重组蛋白表达量较低,占菌体蛋白的6.6%。 5)构建了淇河鲫GH基因毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-GH,并获得了基因工程菌和重组蛋白。 构建了淇河鲫GH基因真核表达载体pPIC9K-GH,该载体经电转化获得了整合有淇河鲫GH基因的重组毕赤酵母基因工程菌,重组菌经甲醇诱导后,成功获得了重组蛋白;表达条件优化试验结果表明,培养液的pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间均对重组蛋白的表达有较大影响,其中诱导重组菌表达的适宜甲醇浓度为0.5~0.75%,适宜在弱偏碱性的培养液中表达,表达的最适pH值为7.0~7.5;诱导2天即达到最大表达量。


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