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酒酒球菌SD-2a胁迫适应性反应及其机制初探

赵文英  
【摘要】: 苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)可使新(生)葡萄酒的生青、酸涩等特点消失,达到理想的酸度平衡,微生物稳定性增强。而能够适应葡萄酒环境、较专一地进行MLF、并对葡萄酒质有增益作用的主要是葡萄酒乳酸菌中的酒酒球菌(Oenococcus oeni)。由于葡萄酒生境恶劣复杂,人工接种诱导MLF时,往往由于菌体的大量死亡,而无法成功启动MLF。究其原因有两方面,一是实验室培养获得的菌体失去了对葡萄酒环境的天然抗性,造成接种存活率下降;二是菌体在冷冻干燥过程中受到损伤,导致冻干后存活细菌数量减少。因此,对于直投式葡萄酒乳酸菌发酵剂生产说,除保证菌体的高密度培养外,更需注重培养条件对菌体接种存活率和冻干存活率影响的研究。酒酒球菌SD-2a是本实验室从山东烟台地区自然MLF葡萄酒中分离得到,并获得国家专利保护的优良菌株。深入研究酒酒球菌SD-2a的胁迫适应性反应机制,对开发具有我国自主产权的直投式葡萄酒乳酸菌发酵制剂,具有重要的理论和实践意义。 本文以酒酒球菌SD-2a为受试菌材,研究不同培养基组成、酸胁迫处理和乙醇胁迫处理对菌体生长、接种存活率、MLF活性及冻干存活率的影响,以评价在培养过程中,诱导菌体发生酸、乙醇胁迫适应性反应对提高菌体存活率的有效性,为直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂的制备提供新的研究思路和基础实验数据。此外,本文通过测定上述培养条件对菌体细胞内MLE活性、H~+-ATP酶活性和细胞膜脂肪酸组分的影响,以期初步探讨酒酒球菌SD-2a的酸、乙醇胁迫适应性反应机制。本文得出的主要结果有: (1)与FMATB和MATB培养基相比,ATB培养基培养获得的菌体,其细胞产量分别增加了8.5%和46.2%;其接种模拟酒培养液后的存活率分别提高了20.3%和40.2%;其冷冻干燥存活率分别提高了48.5%和68.3%;不同培养基条件下,菌体生理状态测定结果表明,与FMATB和MATB培养基相比,ATB培养基培养获得的菌体,其H~+-ATP酶活性分别增加了22.6%和72.8%;其细胞膜中C19cyc11的相对含量分别提高了10.0%和36.8%;其细胞膜U/S值分别提高了20.4%和45.2%。故ATB培养基培养所得菌体,由于自我酸胁迫反应,增强了其对葡萄酒胁迫因素及冷冻干燥的抗性,而该反应与H~+-ATP酶活性增强和菌体细胞膜脂肪酸组分的变化密切相关。 (2)与ATB和MATB培养基相比,FMATB培养基培养获得的菌体,其菌体生长速率分别增加了12.1%和94.5%,其细胞内MLE活性分别增加了33.9%和7.1%。故混合添加有葡萄糖、果糖、苹果酸的FMATB培养基,有利于菌体生长速率及MLF活性的提高。 (3)通过比较酸胁迫条件下,酒酒球菌SD-2a在三种培养基中的最大生长速率和最大OD_(600)值,选择FMATB培养基为酸胁迫处理用培养基。在FMATB培养基条件下,酸胁迫处理降低了酒酒球菌SD-2a菌体的生长速率,且对菌体细胞产量有一定影响,其中,pH3.2处理所获菌体细胞产量约为对照的70%。但酸胁迫处理显著增强了菌体的接种存活率,其中pH3.2处理的菌体接种存活率比对照提高了近9倍。pH3.5和pH3.2处理均能使菌体顺利启动模拟酒培养液的MLF。且酸胁迫处理能显著提高菌体的冻干存活率,其中,pH3.5和pH3.2处理所获菌体的冻干存活率分别为对照的2.2倍和1.9倍。故酸胁迫处理是直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂生产有效的胁迫处理方式,初步筛选出酸胁迫处理条件应设置在pH3.5~3.2之间。 (4)酒酒球菌SD-2a酸胁迫适应性反应机制研究结果表明,酸胁迫处理诱导增强了菌体细胞内MLE活性,其中,pH3.5和pH3.2处理菌体细胞内MLE活性,分别比对照处理提高了23.7%和46.4%;酸胁迫条件诱导增强了菌体H~+-ATP酶活性,其中,pH3.5和pH3.2处理分别是对照处理的1.22和1.39倍;酸胁迫处理明显增加了细胞膜中环丙烷型脂肪酸的相对含量,且pH3.5和pH3.2处理与对照相比显著增加了细胞膜U/S值。故菌体在酸胁迫适应过程中,细胞内MLE活性和H~+-ATP酶活性的升高,细胞膜环丙烷型脂肪酸的聚集及U/S值增加,应与菌体接种存活率和冻干存活率的提高密切相关。 (5)通过比较乙醇胁迫条件下,酒酒球菌SD-2a在三种培养基中的最大生长速率和最大OD_(600)值,选择FMATB培养基为乙醇胁迫处理用培养基。在FMATB培养基条件下,乙醇胁迫处理明显降低了菌体的生长速率和生长量。与酸胁迫处理相比,乙醇胁迫处理对提高菌体的接种存活率及发酵活性,效果不明显。5%乙醇胁迫条件降低了菌体对冷冻干燥的耐受性,而10%乙醇胁迫条件能诱导增强菌体对冷冻干燥的抗性。但总体来讲,乙醇胁迫处理不是直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂生产有效的胁迫处理方式。 (6)酒酒球菌SD-2a乙醇胁迫适应性反应机制研究结果表明,乙醇胁迫条件诱导增加了菌体细胞内MLE的活性,且乙醇浓度越高,菌体细胞内MLE的活性越高;但乙醇胁迫处理却显著抑制了菌体H~+-ATP酶活性;5%乙醇胁迫处理明显增加了细胞膜总饱和脂肪酸的比例,细胞膜U/S值降低;而10%乙醇胁迫处理明显降低了细胞膜总饱和脂肪酸的比例,增加了总不饱和脂肪酸的相对含量,细胞膜U/S值增大。 (7)酒酒球菌SD-2a在10%乙醇胁迫条件下,菌体的生长速率和生长量随着培养基中苹果酸含量增加而增大。菌体生理状态测定结果表明,随着培养基中苹果酸含量的增加,菌体细胞内MLE活性显著增加,且菌体细胞膜U/S值显著增加。故在10%乙醇胁迫存在的条件下,MLF途径及细胞膜脂肪酸组分的调整,能增强菌体的乙醇耐受性,提高了菌体在乙醇胁迫环境中的生长能力。 (8)处于稳定前期的酒酒球菌SD-2a菌体,其冻干存活率高于处于指数中期的菌体。酸胁迫条件和培养基组分都显著影响着菌体的冻干存活率,且两因素间的交互作用极显著。 (9)脂肪酸组分与冻干存活率间具有较强的相关关系,其中C16:0与冻干存活率间存在显著负相关,C19cyc11与冻干存活率之间存在显著正相关。故认为增加细胞膜中C19cyc11的相对含量是酒酒球菌抗冷冻干燥机制之一。 (10)本文的创新点:初次以本土酒酒球菌菌株为试材,进行了酒酒球菌酸、乙醇胁迫适应性反应机制的研究;本文提出在酒酒球菌SD-2a培养过程中,诱导其发生酸胁迫适应性反应可有效提高菌体的存活率,该结论为该菌直投式发酵剂的制备提供了理论支持;首次对酒酒球菌抗冷冻干燥机制进行了初步研究。


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