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猪源乙型脑炎病毒SXBJ07株全长基因组克隆分析及ELISA检测方法的建立

王(韦华)  
【摘要】:流行性乙型脑炎(Epidemic encephalitis B)也称日本脑炎(Japanese encephalitis),是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV,日本脑炎病毒,Epidemic encephalitis virus B)引起的一种重要的蚊媒性人兽共患传染病。乙型脑炎以三带喙库蚊为主要传播媒介,属于自然疫源性疾病,猪被认为是乙型脑炎病毒的重要贮存宿主与增殖宿主,是乙型脑炎的主要传染源,也是对人类威胁最大的扩散宿主。人感染后可引起脑炎症状,轻者留下后遗症,重者可导致死亡。JEV是引起母猪出现繁殖障碍的主要病原体之一,对猪的致死率不高,但可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎,也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育,给养猪业的持续高产发展造成巨大的经济损失。 我国是乙型脑炎发病最多的国家之一。随着时间的变化,JEV在不同的地区存在着潜在的生物学特性变异,这就为乙型脑炎的监控和防制带来了一定的难度。近年来国内外许多学者从猪脑组织、流产的死胎及蚊虫体内分离到乙型脑炎病毒,并对部分毒株进行了基因组全序列的克隆与分析。为了解陕西省猪乙型脑炎的流行状况,本试验对部分地区进行了流行病学调查,从猪脑组织中分离到新的JEV毒株,对其进行全长基因组克隆和分析,并在大肠埃希菌中表达其主要抗原蛋白,建立ELISA检测方法,获得了以下结果: 1.采用乳胶凝集试验和一步反转录套式PCR方法对陕西省部分地区进行猪乙型脑炎病毒的抗体检测及核酸检测,结果表明,已免疫猪场JEV抗体阳性率为94.80%,核酸阳性率为0.56%,可能存在免疫失败现象;未免疫的小型猪场和散养户JEV抗体阳性率为11.72%,核酸阳性率为10.73 %,确诊感染乙型脑炎病毒;该地三带喙库蚊和淡色库蚊为优势蚊种,可能为乙型脑炎传播的主要媒介。 2.采用乳鼠接种试验和BHK-21细胞分离培养试验,从猪脑组织病料中分离获得了具有特异致病性和致细胞病变(CPE)的毒株。根据细胞病变特征、血凝试验结果和间接免疫荧光试验结果,证实分离毒株为乙型脑炎病毒,命名为SXBJ07株。采用RT-PCR法对分离株的PrM基因和E基因进行扩增测序,与SA14株和SA14-14-2株E基因核苷酸的同源性分别为88.4%和87.7%,氨基酸同源性分别为99.0%和97.0%,进一步从分子水平上证实了分离出的病毒为JEV。 3.应用RT-PCR和RACE方法,扩增得到了全长为10 965 bp的SXBJ07株基因组全序列,并对其进行序列分析和同源性比较,结果表明,SXBJ07株5′端和3′端分别存在多个位点碱基的缺失和插入;在E蛋白活性结构域内有13个位点的氨基酸发生了变异;SXBJ07株全基因组序列与参考株比较,与基因Ⅰ型分离株核苷酸同源性为97.2%~99.0%,氨基酸同源性为98.1%~99.8%,其中与JEV/sw/Mie/40株亲缘关系最近;根据PrM基因和E基因进行基因型鉴定,SXBJ07株属于基因Ⅰ型,为陕西省境内首次分离到的基因Ⅰ型JEV毒株。 4.将JEV E蛋白基因插入到原核表达载体pET-32α中,成功构建了E蛋白的重组表达载体;转化DH5α大肠埃希菌,成功表达了E蛋白。对表达的蛋白鉴定证明其与预测的目的蛋白大小一致。Western blot检测结果表明,原核系统表达的E蛋白可以与猪乙型脑炎阳性血清抗体特异性结合。以纯化的JEV E基因表达产物为包被抗原,经方阵滴定、阴阳性界限、特异性试验及批内、批间试验等成功的建立了一种特异、敏感的检测JEV血清抗体的间接ELISA方法,临床应用表明该方法具有很高的特异性和灵敏度。


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