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白腐菌(Trametes pubescecs MB89)漆酶酶学性质及其对酚类化合物的降解特性研究

张莉  
【摘要】:漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,可催化酚类化合物和芳香胺的氧化。担子菌纲中的白腐菌是生产漆酶的一类重要的真菌。随着漆酶研究的深入,漆酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、秸秆生物降解、土壤生物修复和饲料工业等方面得到了越来越广泛的关注和应用。本论文以白腐菌T. pubescens MB89为漆酶生产菌,研究了发酵产漆酶以及酶的分离纯化的条件,游离漆酶和固定化漆酶的酶学性质,同时研究了漆酶对秸秆木素、氯酚化合物和染料的降解作用,得到如下结论: ⑴T. pubescens MB89漆酶的发酵生产 T. pubescens MB89发酵生产漆酶的最佳培养条件为:接种量6.0 mL;碳源为20 g/L葡萄糖,氮源为5.0 g/L蛋白胨;pH5,25℃,110 r/min振荡培养。发酵中期(10 d)添加1.0μmol/L的Cu~(2+)能促进漆酶的分泌,黎芦醇、愈创木酚和苯甲醇对漆酶的分泌都具有诱导作用,其中苯甲醇的诱导效果最强。 ⑵T. pubescens MB89漆酶的分离和纯化 80%硫酸铵沉淀可将90%左右的漆酶从发酵液中分离出来。漆酶粗酶液经过DEAE-Sepharose处理后,在280~610nm之间有两个漆酶主吸收峰,特征峰以峰1的构型为主。用Sephadex G-100分离纯化峰1处得到的漆酶液后,所得的样品的比活力为20.5,活力回收率达到了6%,纯化倍数为16.7。 ⑶T. pubescens MB89漆酶基本酶学性质 ①是一种含糖量为13.3%的分泌型胞外糖蛋白酶,分子量约为60000Da,pI2.8。②最适催化温度为50℃,热稳定性较差。属于耐酸性酶,在偏酸性环境下的酶稳定性优于偏碱性环境中的稳定性。③作用底物广泛,底物为酚类化合物或者是含I-的非酚类化合物时,最适合pH范围为4.0~4.5。④NaN_3是酶促反应的强抑制剂,浓度为0.1 mmol/L的EDTA和1.0 mmol/L的H_2O_2对漆酶有轻微的抑制作用。卤族离子对漆酶活性的抑制效果为F~-Cl~-Br~-,Cl~-和Br~-对漆酶催化活性的抑制具有瞬时的特点。Cu~(2+)、Co~(2+)、K~+、Ag~+对漆酶酶活性有促进作用,Fe~(2+)、Fe3+、Ca~(2+)使漆酶的相对酶活下降,具有抑制作用,Na~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)等离子对漆酶酶活性无显著影响。⑤以ABTS作为底物时,酶促反应的催化效率最高,达到48×10~6 M~(-1)·s~(-1),其次是丁香醛连氮,催化效率可达47×10~6,对具有羟基或甲氧基取代苯酚以及无机亚铁离子的底物,也具有较高的催化活性,对碘离子基本上没有催化活性。 ⑷T. pubescens MB89漆酶固定化 固定化方法和最佳固定条件:①壳聚糖固定化漆酶(IE1):戊二醛的最佳浓度为4%,最适交联时间为8 h,最佳给酶量为1.5 mg/g;②壳聚糖铜固定化(IE2):CuSO_4·5H_2O的最佳添加量为0.6 mg,最适络合时间为10 h,最佳给酶量为0.25 mg/g;③海藻酸钠/壳聚糖固定化(IE3):2%海藻酸钠,2% CaCl_2,1%戊二醛,1.5%壳聚糖。最佳给酶量1.5 mg/g;④TEOB/PEG固定化(IE4):最适PEG分子量为600~800,最佳使用浓度为1.5%,最佳给酶量为1.5mg/g。 IE1和IE4的最适温度均为60℃,IE2和IE3最适合温度为30℃。IE1、IE3和IE4的最适pH值均为4.5,IE2的最适pH为4。与Lac的最适pH值相比,IE的最适pH值均向碱性方向偏移。IE的酸碱稳定性、热稳定性和贮存稳定性都优于Lac。 ⑸T. pubescens MB89漆酶对秸秆木素的降解 ①玉米秸秆可以T. pubescens MB89发酵生产漆酶的碳源。漆酶对木素的降解作用明显优于对纤维素和半纤维素的降解。②秸秆分离木素经过漆酶处理后其聚合度和多分散性都降低。漆酶降解木素主要发生在高分子量木素部分。③漆酶处理使木素酚羟基含量增加,漆酶/ABTS体系使木素酚羟基含量降低。 ⑹T. pubescens MB89漆酶对环境的生物修复 对氯酚化合物的降解:①Lac与DCP、TCP和PCP三种氯酚化合物反应4h,就可以使氯酚降解率达到50%左右;IE降解反应2h,降解率就已经超过50%。②在相同pH值条件下,IE和Lac对TCP的降解效率最高,其次是DCP,PCP的降解效果最差。Lac和IE降解DCP的最佳pH均为5.5, IE1的降解率最大为89.6%,Lac的降解率最小,为82.9%。TCP降解的最佳pH为5.5,IE1、IE3和IE4最大降解率均为92.4%,Lac与IE2的最大降解率接近89%左右。PCP降解结果表明Lac、IE2、IE3和IE4的最佳降解pH为5,IE1的最大降解率出现在pH5.5。③Lac对DCP、TCP和PCP降解的最适温度分别为35℃、45℃和45℃,PCP降解处理中,IE1和IE4的最适作用温度为45℃,IE2和IE3的最适温度为35℃。④Lac降解TCP、DCP和PCP的最佳活力为30 U/mL。IE1降解DCP的添加量为40U/mL,降解TCP的添加量为20U/mL。IE2降解DCP、TCP和PCP的最适添加量为20U/mL,20U/mL和40U/mL。IE3和IE4降解三种氯酚化合物的最佳添加量分别为30U/mL,20U/mL和40U/mL。⑤随着DCP初始浓度的升高,其降解率逐渐降低,但变化趋势缓慢; DCP初始浓度为10 mg/L时,降解率为100%;初始浓度低于10 mg/L,降解率维持在100%的水平,初始浓度高于10 mg/L时,降解率呈缓慢下降趋势。PCP的降解率随初始浓度升高而降低,5 mg/L的降解率最高,达到37.8%,高浓度的PCP (20 mg/L)降解率仅为16.9%。IE在降解氯酚类化合物的时候,底物浓度对降解率的影响要小于对游离漆酶降解效果的影响。⑥在漆酶中添加5 mmol/L ABTS,可在反应30 min内去除69%的PCP,而不加ABTS时,反应17 h后只有24%的PCP被去除。固定化酶在有ABTS存在的环境下,对氯酚的降解作用于游离漆酶差异不大。 对染料的降解:①Lac和IE4对DB作用的最佳pH为4,IE1、IE2和IE3在pH5时对DB的降解率达到最大,在RRG的降解过程中,IE4的最大降解率出现在pH4,Lac和其他几种固定化酶的最适pH为5。Lac和IE对PCP的催化作用都随着pH的升高呈下降趋势,其中IE4对PCP的降解效果随着浓度的变化幅度最大。②IE对DB、RRG和IB的降解效果比Lac的降解效果好。Lac和IE对三种染料的降解率都随着温度的升高呈先上升后下降的趋势。IE3和Lac在40℃时对DB的降解效率最高,IE2在50℃时对RRG的降解率最大,IB最佳降解率出现在IE2,40℃的降解处理中。③随着酶活力的提高,DB、RRG和IB三种染料降解速率的变化趋势相同,即开始时增加显著,随后缓慢上升到逐渐趋于平稳,当酶活力为10U/mL时,三种染料的降解率均达60%。在DB降解过程中,同浓度的IE降解效果要好于Lac,IE1、IE4在浓度为5 U/mL时,对DB脱色率就超过了50%。在RRG降解过程中,Lac和IE的作用无明显差异。IB的降解体系中,IE1和IE3在5 U/mL浓度时,降解率就超过了50%。④染料降解速率随着染料浓度的增加而增加,Lac和IE反应体系中,染料浓度在0~10 mg/mL范围时,反应速率快速增长,继续增加染料浓度,反应速率变化的幅度减小。IE1对三种染料的降解速率要大于Lac和其他三种IE的作用效果。⑤漆酶与染料在反应初期的10min,降解速率较快,Lac体系在反应20min后,降解率趋于稳定,IE体系则在反应40min后,降解率趋于稳定。因此,在Lac反应体系中,反应时间以不超过20min为宜。IE体系中,反应时间以40min为宜。⑥ABTS的添加对蒽醌类染料DB的降解率没有显著影响,在漆酶和偶氮类染料RRG以及靛青类染料IB反应体系中,ABTS的加入明显的提高了降解率,表明漆酶在降解RRG和IB两种染料的过程中,对于体系中的一些小分子物质具有依赖作用。


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