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hBD3基因乳腺特异性表达载体的构建及转hBD3基因牛克隆胚的制备

马晶晶  
【摘要】: 人β-防御素3(humanβdefensin 3,hBD3)分布于人体皮肤、黏膜的上皮细胞中,是一种由45个氨基酸组成的抗菌肽,具有广谱、强效的抗多种微生物感染的作用,特别是对金黄色葡萄球菌等阳性菌有强烈杀伤作用,hBD3作为一种肽类抗生素具有巨大的开发价值。奶牛乳腺生物反应器可利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中高效表达,以期从乳汁中源源不断地获得大量有价值的外源蛋白,因此,通过奶牛乳腺生物反应器来高效表达hBD3基因,可以解决hBD3来源有限和化学合成成本高的问题。构建能够高效表达目的蛋白的乳腺表达载体是制备乳腺生物反应器的关键,基于此,本研究通过克隆包括完整的外显子区和内含子区的hBD3基因,构建hBD3乳腺特异性表达载体pEBB,用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞并对其表达进行检测。然后,将该载体转入胎牛成纤维细胞,得到的阳性细胞通过体细胞核移植(SCNT)来产生转hBD3基因的克隆囊胚。结果如下: 1.通过PCR技术成功的从人胎盘组织中扩增出长度为1156 bp的hBD3基因,包括完整的外显子区和内含子区。序列分析表明,所克隆的基因与GeneBank上公布的hBD3基因序列同源性达99 %,密码子阅读框正确,有4个位点发生突变,这4个位点均在内含子区,不会对基因表达造成影响。 2.利用平末端克隆的方法,将hBD3基因表达序列与初级乳腺特异性表达载体pBCP融合在一起,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建了含有抗性基因neo和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的hBD3非融合型乳腺特异性表达载体pEBB。 3.通过脂质体法将表达载体pEBB转入体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,经G418抗性筛选,得到的阳性细胞可稳定地表达绿色荧光蛋白,并且主要在细胞质中表达,将这些阳性细胞经扩大培养得到了转hBD3基因的奶牛乳腺上皮细胞。RT-PCR法检测结果表明含有内含子的hBD3基因可在牛乳腺上皮细胞中初步表达,该载体pEBB可用来制备高效表达hBD3的奶牛乳腺生物反应器。 4.筛选出的转hBD3基因的胎牛成纤维细胞经体细胞核移植成功发育到囊胚,经PCR鉴定,hBD3基因已整合到胚胎基因组中,这些胚胎可通过胚胎移植生产转人β防御素3基因的奶牛。


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