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苹果和猕猴桃抗坏血酸形成与积累的生理和分子机理研究

李明军  
【摘要】:抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA),又名维生素C(Vitamin C,Vc),是生物体内重要的抗氧化剂和许多酶的辅因子。植物体内的AsA不仅与自身生长发育和逆境的抗性密切相关,而且由于人类自身不能合成AsA,它又是人体重要的天然AsA来源,与人类的健康密切相关。目前,对AsA在作物可食部分积累机制及其AsA含量差异的原因尚不清楚。本文以低AsA含量的苹果(Malus domestica Borkh‘Gala’)和高AsA含量的猕猴桃(Actinidia deliciosa cv. Qinmei)为材料,从AsA的组织分配、生物合成、再生、运输及光调控等方面对AsA形成和积累机理进行了研究。获得的主要结果如下: 1.从苹果果实中克隆获得了AsA再生酶MDHAR和DHAR2及合成酶GME和GalUR基因cDNA全长或部分序列。其中,MDHAR长1400 bp,包含了1305 bp的完整开放阅读框,编码一个膜结合MDHAR;DHAR2长933 bp,包含了798 bp的完整开放阅读框,属于GSH依赖性胞质DHAR;GME长1323 bp,包含了1131 bp的完整开放阅读框,序列分析发现其编码一个NAD依赖性胞质酶。而GalUR长668 bp,与草莓GalUR氨基酸同源性高达80%,为GalUR基因的cDNA部分序列。 2.在‘嘎啦’苹果果实的果皮、果肉中检测到了AsA合成关键酶GalDH和GalLDH基因mRNA的表达和活性;通过不同AsA合成前体物饲喂发现,参与L-半乳糖途径的L-Gal和L-GL能引起果皮和果肉AsA含量的明显增加,D-GalUA也能引起果皮AsA含量的明显增加,且幼果的增加幅度高于成熟果。在果实的不同组织中,高AsA含量的果皮有高的AsA合成和再生酶基因的表达量和活性;果皮中AsA含量受光的调控,与阴面果皮相比,阳面果皮具有高的GalDH、GalLDH、GalUR及MDHAR、DHAR mRNA表达量和活性,而阳面和阴面果肉间则无明显差异。对苹果AsA运输的初步研究发现,在果实微管组织中存在大量AsA的积累,且在具有AsA合成能力的果柄和叶柄韧皮部及其卸载液中也存在大量AsA,但果柄施加外源AsA并不能引起果实AsA含量的增加。这表明在苹果中AsA可能能从叶片运输到果实,但在果实中不能很好的卸载从而在维管束中积累;或者这些组织中自身合成的AsA仅在果柄或叶柄中发挥它的抗氧化等功能,而与果实和叶片间AsA运输关系不大。这些结果表明生物合成是苹果AsA形成的主要原因。 3.光直接影响苹果叶片和果皮中的AsA合成和代谢。在弱光条件下,苹果叶片和果皮中AsA合成酶GalDH和GalLDH mRNA表达量与活性及再生能力明显降低,AsA含量下降。果实或整个树体遮光后,果肉组织中GalDH和GalLDH转录水平及其活性和再生酶活性均无明显变化。果实遮光对果肉AsA水平无明显影响,但整个树体遮光20 d后果肉中T-AsA和AsA含量明显降低,且树冠底部内膛果实果肉的AsA含量也较低。这说明苹果果肉组织中AsA的合成和代谢能力不直接受光的调控,但光可通过影响叶片间接地对果肉中AsA含量起到调控作用。 4.在苹果果实生长发育过程中,单位鲜重果实中T-AsA和AsA含量在花后0 d的子房中最高,之后随着生长发育逐渐下降,在花后60 d后至果实成熟基本保持不变。从单个果实中AsA的积累量来看,在整个果实生长发育过程中AsA积累一直在发生,即在单个果实中AsA合成速率一直大于DHA的降解速率。在果实生长发育过程中,AsA合成酶基因表达量表现出不同的变化模式。GME、GGP和GalUR mRNA表达量在果实生长发育过程中显著地增加与AsA含量的变化不一致,表明它们对AsA含量不起关键调控作用。GPP在果实发育过程中与单位鲜重中AsA含量的变化模式存在相似性。在幼果期果实高的GalDH和GalLDH mRNA表达量和酶活性与幼果期由L-Gal和L-GL合成AsA的能力相一致。在AsA再生系统中,MDHAR mRNA表达量和酶活性随果实的生长表现出明显的下降趋势,与AsA/DHA比值呈负相关。 5.为了探索叶片AsA形成与调控和果实的异同点,研究了不同叶龄苹果叶片AsA形成及其与合成和再生的调控关系。结果表明,在不同叶龄的苹果叶片中,AsA的积累主要发生在幼叶向成熟叶的转变期,该时期叶片有高的AsA合成和再生能力,而衰老期AsA合成和再生能力下降,AsA含量降低。在AsA合成中,GPP的转录调控可能对苹果叶片AsA水平起着重要的调控作用,而GMP、GGP、GalLDH表达量的变化模式表明它们对AsA水平不具有调控功能。此外,GGP和GalUR在老叶中高的表达量可能与衰老有关。在再生系统中,MDHAR表达量和活性与苹果叶片中DHA含量相关,表明MDHAR可能在维持植物AsA氧化还原状态中起重要作用。而在AsA水平稳定的成熟叶中高的DHAR表达量和活性表明DHAR在维持AsA合成和氧化降解之间的平衡中可能起重要作用。 6.从美味猕猴桃品种‘秦美’果实中克隆获得了MDHAR、DHAR2和GME基因cDNA部分序列及DHAR1和GPP基因的cDNA全长序列。其中,MDHAR长1019 bp,属于膜结合MDHAR基因的cDNA部分序列; DHAR1长821 bp,包含了639 bp的完整开放阅读框,而DHAR2长542 bp,包含5′端起始密码子ATG,分别与已报道的两种植物胞质DHAR有高度的同源性,均为GSH依赖性胞质DHAR;GME长846 bp,与其它植物GME基因氨基酸同源性多在90%以上,为美味猕猴桃GME基因的cDNA部分序列;GGP为1542 bp,包含1353 bp的完全开放阅读框,对其编码蛋白结构分析发现,它具有螺旋跨膜区,是一个膜结合蛋白。 7.在美味猕猴桃品种‘秦美’果实中也检测到了AsA合成酶GalUR、GalDH和GalLDH mRNA表达及GalDH和GalLDH活性。不同AsA合成前体物饲喂发现,不仅参与L-半乳糖途径的L-Gal和L-GL能引起果实AsA含量的显著增加,而且L-GulL和D-GalUA也能引起AsA含量的明显增加,且幼果高于成熟果。这说明猕猴桃果实具有AsA合成能力,且可能存在多个途径。在果实的不同组织中,有高AsA合成和再生酶基因表达和活性的果肉及种子区有最高的AsA含量,而合成酶基因表达量和活性水平较低的中轴AsA含量很低。同时,猕猴桃果实AsA的分布也存在细胞特异性,果皮细胞中几乎观察不到AsA的存在;在果肉细胞中,大细胞不仅胞内有大量的AsA积累,而且在其细胞壁上也有AsA的存在;中轴细胞中AsA主要分布在细胞壁等质外体;维管束的导管细胞中也存在大量的AsA。对猕猴桃AsA运输能力的研究表明,果柄和叶柄中自身合成的AsA可能仅在果柄或叶柄中发挥抗氧化等功能,而与果实与叶片间AsA运输关系无关。但幼果期果柄施加外源蔗糖能引起幼果AsA含量的明显增加,表明猕猴桃果实中的AsA可能与叶片糖源的供应能力有关。这些结果也说明猕猴桃果实中AsA形成的主要原因是自身合成,同时叶片的糖源供应能力可能调控着幼果期果肉中AsA合成速率。 8.猕猴桃果实套袋遮光不影响果实中AsA含量,但幼果中AsA水平明显受日变化的影响,清晨6:00比中午和下午的AsA含量明显低。在果实不同发育阶段树体遮光处理中,花后0-40 d间遮光能显著降低幼果中T-AsA和AsA含量,而花后40 d后遮光对AsA含量无明显影响。这表明光不直接影响猕猴桃果实中AsA含量,但能通过叶片影响幼果中AsA含量。猕猴桃树体遮光显著降低了叶片AsA合成和再生酶基因的表达量和活性,引起了AsA含量显著下降和DHA增加。尽管如此,花后0-40 d树体遮光也显著降低了花后40 d猕猴桃果实中AsA合成酶GalLDH、GalDH、GPP、GME和GalUR及再生酶MDHAR和DHAR mRNA表达量,并降低了GalLDH、GalDH、MDHAR和DHAR活性,幼果AsA含量和积累量下降,40 d后果实生长速率下降,果实变小。而花后40-120 d遮光虽引起了糖含量的显著下降,但对AsA含量、合成和再生无明显影响。这表明花后0-40 d树体遮光降低了猕猴桃幼果AsA合成能力。外源蔗糖对幼果AsA含量的增加表明花后0-40 d遮光处理对猕猴桃幼果AsA合成的影响可能与淀粉、可溶性总糖和蔗糖含量的明显降低有关。这些结果表明光不直接影响猕猴桃果实AsA含量和合成,但能通过影响叶片对果实的糖供应能力或其它信号调控幼果AsA合成和再生能力,间接调控着幼果中AsA含量和果实中AsA积累量,且这种对幼果AsA含量的影响可能与后期果实膨大有关。 9.在猕猴桃果实生长发育过程中,单位鲜重果实中T-AsA和AsA含量在花后迅速增加,并在花后30 d达到最高,之后逐渐下降,在花后60 d后至果实成熟基本保持不变。从单个果实中AsA的积累量来看,T-AsA和AsA积累量在花后伴随果实的生长迅速增加,在花后45 d达到最高,之后至果实成熟期保持不变。这说明猕猴桃果实中AsA的积累主要发生在花后45 d前的幼果期。在果实生长发育过程中,GPP和GGP在转录水平上对果实AsA合成调控的可能性最大,特别是GPP,而从GalLDH、GalDH、GMP和GME转录水平的变化模式来看,它们对AsA合成调控的可能性很小。在AsA再生系统中,MDHAR和DHAR表达量及活性与幼果期AsA的快速积累关系不大。但45 d后高的表达和活性(尤其MDHAR)可能与AsA水平的维持有关。在碳水化合物中,可溶性总糖、还原糖和淀粉含量与AsA的变化模式均不存在相关性,但在花后45 d之前的幼果期蔗糖和淀粉的变化模式与AsA含量有着相似性,说明蔗糖可能与幼果期猕猴桃果实中AsA的合成有一定的关系。 总之,苹果和猕猴桃果实中AsA形成的主要原因是自身的生物合成。与苹果相比,猕猴桃不仅有着高的AsA合成能力,还可能存在D-半乳糖醛酸等支路途径。叶片可通过影响糖源的供应或其它物质调控着果实中AsA的合成能力,进而不可逆的影响着果实中AsA含量和积累量。从整个果实中AsA积累模式来看,‘嘎啦’苹果在整个果实发育过程中均有AsA的积累发生,但积累速率低;猕猴桃果实中AsA积累主要发生在花后45 d前,之后至果实成熟基本维持不变,且在花后30 d前幼果中的AsA积累量明显大于果实变大对细胞中AsA的稀释作用,是猕猴桃高AsA积累的主要时期。从AsA水平的维持来看,虽然MDHAR和DHAR对苹果和猕猴桃果实AsA的积累量不起关键作用,但它们在维持AsA氧化还原状态及AsA合成和氧化降解的平衡中起着重要作用。与苹果相比,猕猴桃果实有显著高的MDHAR和DHAR活性,低的AsA氧化程度,这也是猕猴桃果实高AsA含量的另一原因。通过对苹果和猕猴桃果实发育过程中、不同叶龄的苹果叶片中及猕猴桃树体遮光下AsA合成和代谢酶基因转录水平与AsA含量和积累量的关系研究发现,在AsA合成的L-半乳糖途径中GPP的转录调控对AsA的合成与积累起着重要的调控作用,它可能是L-半乳糖途径合成AsA的关键调控基因。


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