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耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化

周煌凯  
【摘要】: 木聚糖作为重要的半纤维素,是自然界中除纤维素以外含量最高的可再生资源。谷物饲料中存在的木聚糖是阻碍营养物质消化的主要抗营养因子之一,它使饲料消化利用率大大降低,阻碍畜禽的生长发育。目前安全有效的方法就是通过生物技术即利用木聚糖酶降解木聚糖。现有手段多是从极端环境中筛选木聚糖酶高产菌株,这是一种方便直接的好方法。但这种方法毕竟受到地域环境和经济条件的限制,所以从分子水平去改造木聚糖酶基因,就成为广大科研工作者切实可行的技术。 表达载体和宿主的选择对于木聚糖酶基因的表达起着至关重要的作用。枯草芽孢杆菌是继大肠杆菌之后又一广泛使用的表达系统,它没有致病性,只具有单层细胞外膜,并且能直接将许多蛋白分泌到培养基中。因此本研究选择枯草芽孢杆菌为木聚糖酶基因表达宿主菌。 本研究成功构建了木聚糖酶表达载体pXN112,采用电转化法将表达载体pXN112转入枯草芽孢杆菌1A747中,得到重组菌BXN112,然后进行诱导表达以及发酵条件的优化。整个试验分两个部分进行。 (1)从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌BYG5-20中克隆得到带有自身信号肽的木聚糖酶基因xynA,将其克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148中得到中间质粒pGJ148-xynA。再将壮观霉素抗性基因片段spec克隆入pGJ148-xynA中,最终构建得到木聚糖酶表达载体pXN112。测序与酶切结果显示表达载体构建成功。 (2)采用电转化法将表达载体pXN112转入枯草芽孢杆菌1A747中,得到重组菌BXN112,然后进行诱导表达以及发酵条件的优化。 将BX112,在37℃诱导表达24h后取胞外上清,然后进行酶活力测定以及SDS-PAGE分析。结果表明,木聚糖酶基因同源信号肽在枯草芽孢杆菌中可以正常发挥作用,表达产物可以分泌到胞外,属于分泌型表达;胞外上清木聚糖酶的酶活力可达54.13 IU/mL;表达产物分子量为25 kDa。 在进一步的发酵条件优化实验中,以发酵温度、pH值、培养时间以及碳氮源条件为优化条件进行单因素试验。确定定的最佳发酵工艺参数为:温度37℃、pH值8.0、培养时间24h。最佳发酵培养基配方为:蛋白陈(Tryptno),1%;酵母抽提物(Yeast extract),0.5%;NaCl,1%;山梨醇,1%;4%麦芽糖为诱导物。优化后木聚糖酶的表达量达到93.32IU/ml。


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