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黏型小麦雄性不育系线粒体嵌合基因的克隆与表达及其mtDNA消减文库的构建

胡俊敏  
【摘要】: 黏类小麦不育系其线粒体基因组来自黏果山羊草(Ae.kotschyi)、易变山羊草(Ae.variabilis)、偏凸山羊草(Ae. ventricosa)和二角山羊草(Ae. bicornis),在该类不育系中,由于育性基因单一,不育性彻底,易恢复性高,为小麦雄性不育研究和杂种优势利用提供了极有利的材料基础。本研究以黏类小麦细胞质雄性不育系中的黏型不育系ms(Kots)-90-110(A)和其近等基因系BC5F2为实验材料,根据T型小麦嵌合基因orf256的序列设计引物,在黏型小麦不育系及其近等基因系中进行扩增,对扩增到的基因片段进行克隆和序列分析。同时,为进一步探讨嵌合基因的表达与黏型小麦花粉败育的关系,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对嵌合基因在小麦不育系及其近等基因系叶片和不同发育时期花药中的转录本表达模式亦进行了分析。此外,本实验为了从源头上寻找育性差异基因,以黏型小麦细胞质雄性不育系ms(Kots)-90-110(A)和其近等基因系BC4F1为实验材料,应用消减抑制杂交技术(SSH)构建了黏型小麦雄性不育系的线粒体DNA文库,为研究小麦线粒体基因组提供了技术支撑。获得的研究结果如下: 1.根据T型小麦不育系中嵌合基因orf256tim的序列设计引物分别在黏型小麦不育系及其近等基因系的叶片mtDNA和花药细胞发育的二核期的cDNA中扩增,分别获得了orf256kot和orf260kot基因,说明其转录本长度发生变化。由于本研究实验材料除育性有差异外,其它遗传背景完全一致,因此orf256kot转变为orf260kot应该是恢复基因介导的结果。进一步的氨基酸序列分析发现,orf256kot在不育系中编码256个氨基酸,而在相同细胞质的可育系中转变为编码260个氨基酸的orf260kot,且两者氨基酸的改变与缺失多数集中在跨膜区,说明这些插入的氨基酸可能与小麦育性的表型差异有关。 2.以黏型小麦细胞质雄性不育系及近等基因系的叶片和处于不同发育时期的花药cDNA为模板,采用半定量RT-PCR检测orf256kot和orf260kot与邻近的coxI双顺反子转录本和coxI单顺反子转录本在不育系和可育系中的表达模式,同时采用荧光定量PCR技术分析了orf256kot和orf260kot单顺反子转录本的表达情况。结果表明:orf256kot和orf256kot—coxI转录本的表达量在不育系花药开始败育的二核期最高,但coxI的表达量低于可育系,表明orf256kot可能参与了花药败育的调控。而在可育系中orf260kot—coxI双顺反子转录本的表达量在二核期显著低于不育系,进一步说明orf256kot可能介导了花药的败育,而恢复基因通过抑制orf260kot—coxI转录本的表达而恢复花药的育性。 3.应用SSH技术以黏型小麦不育系ms(Kots)-90-110(A)线粒体DNA为检测子,其近等基因系BC4F1线粒体DNA为驱动子,构建了黏型小麦细胞质雄性不育系的mtDNA消减文库,并对其文库中的全部扩增产物和6条单条带扩增产物进行克隆转化,对其序列进行研究分析发现,SSH文库的单条带扩增产物中约90%的序列来源于线粒体基因nad1和nad5的非编码区。


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