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大豆重要抗逆相关基因GmE2、GmNAC2a的特性分析及功能鉴定

韩巧玲  
【摘要】: 本实验前期工作已经证明GmDREB5可以显著提高转基因植物的抗逆性,为了研究GmDREB5在蛋白水平的调控机制,前期工作采用酵母双杂交系统筛选到一些GmDREB5的互作蛋白。GmE2是筛选获得的与GmDREB5互作的蛋白。本研究进一步对GmE2进行了分析。GmE2属于泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme),依赖于ATP的泛素降解蛋白系统包括E1、E2和E3三个重要蛋白,GmE2属于E2蛋白。本研究还通过NTT筛选系统(核蛋白筛选系统)从大豆耐盐品种铁丰八号中筛选到的抗逆相关基因GmNAC2a。GmNAC2a属于NAC类转录因子家族,NAC类转录因子不仅对植物的生长发育有重要影响,而且在生物和非生物胁迫响应途径中发挥重要作用。本研对GmE2和GmNAC2a基因的特性及功能进行了研究,结果如下: (1)GmE2基因长度为462bp,编码153个氨基酸,第89位半胱氨酸为预测的活性位点,第7位至146位氨基酸为UBCc结构域,第8、65、66、99、100位为预测的与泛素连接酶E3互作的位点。 (2)GmE2的亚细胞定位及表达特性分析结果证明,GmE2定位于细胞核中。GmE2对干旱、低温、ABA、乙烯等非生物胁迫均有响应,对高温和高盐胁迫没有响应。 (3)利用农杆菌介导法将GmE2转入烟草和拟南芥。GmE2功能鉴定证明,转GmE2基因烟草对高温和高盐处理的反应与野生型烟草比较无明显差异。而在干旱胁迫条件下转基因烟草的发芽率明显高于野生型,说明GmE2可以提高转基因植物的抗旱性,而对耐盐性及耐热性的影响不大。 (4)GmNAC2a基因长度为900bp,编码299个氨基酸,在GmNAC2a的N端包含1个NAM保守域。系统进化树分析表明GmNAC2a属于ATAF亚族,GmNAC2a与花生NAC转录因子家族成员AhNAC1亲缘关系最近,同源性达到76.47%。 (5)GmNAC2a的亚细胞定位和表达特性分析结果表明,GmNAC2a定位于细胞核中。在大豆中,GmNAC2a基因对干旱、高温、低温、高盐、ABA、乙烯等多种胁迫均有响应,其中对乙烯响应最为敏感,证明GmNAC2a基因可能作为交叉点,不仅参与非生物胁迫响应途径,而且可能参与乙烯相关的生物响应途径。 (6)利用农杆菌介导法将GmNAC2a转化烟草,PCR及RT-PCR结果证明GmNAC2a已整合到转基因植物基因组中并可以表达。基因功能分析表明,转GmNAC2a基因烟草与野生型烟草对高盐胁迫的耐受能力差异不大。但是,转基因烟草经过高盐处理后,出现了提前开花的现象;在茎顶端出现了簇生不定芽。根据已发表的文章推测GmNAC2a基因可能参与植物生长发育的调节,促进顶端分生组织的分化。 本研究从大豆中克隆了两个重要抗逆基因GmE2、GmNAC2a。表达特性分析证明GmE2和GmNAC2a不同程度参与了大豆各种非生物胁迫的响应。对GmE2的特性及生物学功能进行研究为进一步阐明GmDREB5蛋白水平的调控机制创造了条件。GmNAC2a的功能研究为筛选新的抗逆基因提供了重要依据。


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