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中国野葡萄锌指蛋白基因克隆及葡萄再生体系的建立

文志丰  
【摘要】: 葡萄白粉病[Uncinula necato (Schw. )Burr.]是危害葡萄生产主要的真菌病害之一。中国野生华东葡萄白河-35-1对白粉病具有很高的抗性,因此进行华东葡萄抗白粉病基因克隆及其功能研究具有重要的意义。本研究一方面是在课题组前期研究获得中国野生华东葡萄(V. pseudoreticulata)白河-35-1抗白粉病差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,进行中国野生华东葡萄抗白粉病锌指蛋白基因克隆;另一方面是以华东葡萄白河-35-1、湖南-1和葡萄品种红地球(V. vinifera)的叶片和叶柄为材料,通过器官发生途径和胚状体发生途径,研究了不同激素浓度、培养基对不定芽再生的影响,取得以下主要结果: 1根据中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病差异cDNA片段T11GG/B0324-292设计特异PCR引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列。该cDNA全长2663 bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框架,编码区全长2223 bp,编码1个由740个氨基酸的组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),该cDNA5′和3′非翻译区长度分别为395 bp和44 bp。多重比较分析表明,中国野葡萄锌指蛋白基因推导的氨基酸序列与拟南芥(A. thaliana)、蒺藜苜蓿(M. truncatula)、水稻(O. sativa)的C3H亚型CCCH型锌指蛋白转录因子同源性分别为61%,70%和60%。这是目前克隆的第一个葡萄锌指蛋白基因。 2华东葡萄湖南-1无菌苗初代培养基为MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L+AC1.0g/L,继代培养基为1/2MS+IBA 0.15mg/L+NAA0 .02mg/L +AC 1.0g/L,花药愈伤组织在B5+2.0 mg/ LTDZ+0.5 mg/L2.4-D+CH500 mg/L+1g/lPVP生长状态最好,生长时间最长。华东葡萄白河-35-1的愈伤再分化芽的培养基B5+3.0 mg/ LTDZ +0.2mg /LNAA+CH500 mg/L+1 g/lAC,再生芽的诱导率是6.67%。欧洲葡萄品种红地球的愈伤再分化芽培养基为MS + 2.0 mg/ LTDZ +0.1 mg/ LNAA+ CH 500 mg/L +1 g/l AC,再生芽的诱导率是10%。


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