拟南芥miR396和26S蛋白酶体途径调节叶片近—远轴面极性建成的机理研究

【摘要】： 在叶发育过程中,近-远轴面极性的正确建立是叶片后续形态建成和功能发挥的基础。近年来,研究发现叶片近-远轴极性建立是一个非常复杂的过程,涉及错综复杂的基因调控网络,包括转录因子的转录调控、非编码小RNA介导的转录后调控以及核糖体蛋白和26S蛋白酶体分别在蛋白翻译和蛋白降解等多个方面的调控作用。其中有两类小RNA分子:miR165/166和tasiR-ARF在转录后水平通过调节转录因子基因的表达在叶片近-远轴极性建成过程中发挥重要作用,但目前还不清楚是否有其它小RNA也参与叶片的极性建成过程。前人的研究发现具有蛋白降解功能26S蛋白酶体参与了叶片近-远轴极性的建成,但目前还不清楚26S蛋白酶体调控的靶标基因是什么以及其如何参与叶极性建成的。 本研究主要对拟南芥miR396在叶极性建成过程中的功能进行了分析,研究发现miR396通过负调节GROWTH-REGULATING FACTORs (AtGRFs)转录因子基因的表达来调控叶片细胞的增殖,进而影响叶片近-远轴面极性的建成。我们构建了miR396的过量表达载体并将其转入野生型拟南芥中,结果发现转基因植物叶片狭长,叶片细胞数目减少而体积增大。分子水平检测发现miR396的过量表达导致其靶基因AtGRFs基因表达水平的下调,这表明miR396通过调控AtGRFs基因的表达进而控制叶片细胞增殖来影响叶片的发育。ASYMMETRIC LEAVES1和2(AS1和AS2)是拟南芥叶片近轴面极性建立的重要决定因子。进一步,我们在as1/2突变体中过量表达miR396,结果发现转基因植物出现许多近-远轴极性严重缺陷的荷叶状叶或棒状叶,显著增强了as1/2近轴面发育的缺陷,这种极性缺陷可以被抗miR396裂解的AtGRF9基因的过量表达所回复,表明miR396通过负调控靶基因AtGRFs的表达,控制细胞增殖来调节叶片近-远轴面的极性建成。叶片细胞的增殖在很大程度上依赖于细胞有丝分裂周期的正常进行。在过量表达miR396的转基因植物中检测细胞周期相关标志性基因的表达,发现所检测的代表细胞周期4个时期的标志性基因表达水平都显著下调,表明miR396-AtGRFs途径可能通过调节细胞有丝分裂周期的进入来控制细胞的增殖。同时,我们还发现miR396通过负调节AtGRFs基因的表达来调控表皮毛发育相关基因的表达,参与叶片表皮毛的生成。以上结果表明,在叶极性建成过程中细胞增殖和分化的协同需要miR396-AtGRFs途径的参与。 为了解析26S蛋白酶体调控叶极性建成的机理,我们以ae3-2 as1-1双突变体为材料,通过EMS诱变筛选能够回复双突变体近轴面极性缺陷的回复子来寻找26S蛋白酶体调控与叶极性发育相关的靶基因,解析其参与叶极性建成的分子机理。本研究分析了一个ae3-2 as1-1的回复子突变体107。107基因的突变体可以回复ae3-2 as1-1双突变体叶极性缺陷的针状叶和荷状叶,并且通过分析其侧交的F2代的分离比,发现其符合孟德尔的自由组合规律。另外我们通过遗传分析得到了107的单突变体,发现其具有多样化的表型,如花器官发育有缺陷,叶边缘有很深的锯齿等。利用一系列分子标记,我们对107基因进行了定位,发现107基因位于五号染色体的上臂,在此区段内一个蛋白激酶基因的突变体与107突变体具有相似的表型,通过测序分析发现107基因可能编码这个蛋白激酶基因。我们正在分析107基因调控叶的极性建成的分子机理及其与26S蛋白酶体之间的关系。