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脂肪基质细胞的生物学特性研究及体细胞的重编程载体制备

高倩  
【摘要】: 干细胞研究与应用在疾病治疗、新药研发、药效和毒性评估、克隆动物、转基因动物生产、发育生物学等多个领域产生了极其重要的影响。理论上,胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)具有无限增殖和分化为所有类型细胞的能力,然而由于存在伦理争议和免疫排斥等问题,其应用受到限制。近年的研究倾向于寻找可替代ESCs的细胞类型,如对成体干细胞、通过核移植或重编程的方法获得的与ESCs相似的亚全能干细胞等的研究为干细胞的应用提供了更广阔的前景。脂肪基质细胞(adipose-derived stromal cells, ADSCs)由于来源广泛,取材方便,干细胞含量高等特点,已成为成体干细胞研究的热点,然而ADSCs的自我更新和多向分化潜能的分子基础尚不明确,且体外增殖和分化能力受到一定的限制。在ESCs亚全能分化特性维持机制中,Oct3/4、Sox2和Nanog起到了核心作用,因此,本研究着眼于ADSCs中多潜能转录因子的表达情况以及构建体细胞重编程载体的研究,以期为干细胞的研究提供更好的实验材料。 本研究以15日龄SD大鼠为实验动物,采集腹股沟皮下脂肪组织,通过胶原酶消化法获得ADCs,培养在DMEM生长培养基中。传代培养后利用RT-PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪分析和特异性染色等细胞生物学和分子生物学实验技术鉴定了大鼠ADCs的基本生物学特性和多潜能转录因子的表达情况;通过特定因子诱导其向脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞分化,并利用上述实验技术对其分化能力进行了评估;获得了包含多潜能转录因子Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4的慢病毒表达载体,并对其进行了鉴定、包装、浓缩及侵染能力检测,为ADSCs的自我更新和多向分化潜能的分子机理及重编程为iPS细胞的研究奠定了基础。 1、大鼠ADSCs的分离培养 从大鼠腹股沟皮下脂肪组织分离获得ADSCs,培养在DMEM完全培养基中,并进行传代培养。实验证明,新鲜接种的ADSCs是一种混合的细胞群,呈三角形、梭形、球形或多角形,传代培养后,球形、三角形和多角形细胞不断减少,细胞形态趋于一致,多呈梭形,并且形成了成纤维样的细胞集落。 2、大鼠ADSCs生物学特性的检测 RT-PCR检测结果证明大鼠ADSCs不仅表达多潜能转录因子Oct3/4、Sox2和Nanog,而且其下游的靶基因如cMyc、Fgf4、Gal等在ADSCs中也有表达;免疫细胞化学分析表明ADSCs表达间充质干细胞表面标志CD105,而不表达造血干细胞表面标志CD34和内皮细胞表面标志CD31,并且多潜能转录因子Oct3/4、Sox2、Nanog以及cMyc和端粒酶在ADSCs的细胞核和细胞质内都有表达,而胚胎阶段性抗原SSEA1主要在细胞质内表达;流式细胞仪检测显示第2代大鼠ADSCs中Oct3/4,Sox2,Nanog和SSEA1的表达水平分别为2.0%,3.7%,2.4%和2.6%;并且碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色呈阳性。 3、大鼠ADSCs诱导分化为脂肪细胞 体外通过胰岛素、氢化可的松和转铁蛋白诱导第2代大鼠ADSCs,发现诱导1天即有个别细胞中出现了脂滴,随着诱导时间的延长,脂滴不断积累并融合形成大脂滴,油红O染色呈阳性,诱导11d后,RT-PCR检测表达脂肪细胞标志基因PPARγ、FAS和LPL,并且与对照组相比差异显著。 4、大鼠ADSCs诱导分化为成骨细胞 体外可通过氯化锂诱导ADSCs分化为成骨细胞。氯化锂诱导1天后,细胞形态由成纤维样转变成方块状,随着诱导时间的延长,AP活性不断提高,并且形成了广泛的钙化结节,茜素红染色呈阳性,免疫细胞化学染色结果显示表达成骨细胞特异性标志蛋白OSX和OPN。 5、大鼠ADSCs诱导分化为神经细胞 通过在无血清培养基中添加β-巯基乙醇可诱导ADSCs分化为神经样细胞,诱导20min后,细胞内缩并伸出突触,1h后,形成了具有多级突触的神经元样细胞,并连接成网,免疫细胞化学染色检测表达神经细胞特异性蛋白Nestin、Tau和NF。 6、多潜能转录因子载体的鉴定、包装及转染 通过PCR和酶切的方法鉴定四个慢病毒转移载体(中国科学院上海生命科学研究院肖磊博士馈赠),结果显示四个慢病毒载体中分别包含了人的多潜能转录因子Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4的ORF序列,然后在293T细胞中包装获得病毒上清液,高速离心浓缩,并转染大鼠ADSCs测定转染效率,发现获得的病毒液转染效率太低,不适合进行后面的研究。 综上所述,本实验成功的分离了大鼠ADSCs,并对其进行了生物学特性研究,结果证明ADSCs表达间充质干细胞表面标志CD 105,不表达造血干细胞表面标志CD34和表皮细胞表面标志CD31,并且表达多种胚胎干细胞特异性的多潜能转录因子,在本实验建立的诱导体系下具有向脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞分化的潜能。此外,本实验成功制备了体细胞重编程载体,但其感染效率仍需提高。


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