小麦中与条锈菌互作相关基因的克隆以及表达谱和功能的初步分析

【摘要】： 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)引起的小麦条锈病是小麦生产上一种重要的真菌病害,对我国小麦生产造成严重威胁。培育和种植小麦抗病品种是防治条锈病最经济、有效、安全的举措。因此,克隆小麦中参与与条锈菌互作的相关基因,分析其表达特征和功能,以阐明小麦与条锈菌互作的分子机理,可为小麦抗条锈品种选育和遗传改良提供理论基础。本研究结合同源克隆、RACE、电子克隆、数据库挖掘等基因克隆手段,在小麦品种水源11中克隆出13个可能参与了小麦与条锈互作的基因,并对部分基因进行了生物信息学和表达谱分析以及功能的初步验证,研究的主要内容和结果如下: (1)为研究小麦SNARE蛋白在小麦与条锈菌互作中的功能,利用同源克隆和RACE获得小麦TaNpsn11和TaNpsn13基因全长cDNA,通过检索TIGR小麦数据库克隆得到另外9个SNARE基因,分别为3个R-SNARE:Tav-Snare13、TaVamp725和TaSec22;2个Qa-SNARE:TaSyp132和TaSyp22;2个Qb-SNARE:TaNpsn12和TaBet1;1个Qc-SNARE:TaSyp51,以及一个Qb+c-SNARE:TaSnap28。 (2)对植物特有的NPSN家族基因进行了表达特征分析,发现TaNpsn11~13各自在小麦的根、茎、叶组织中差异表达,其可能在器官的分化和发育过程中起着一定作用;与条锈菌互作中3个基因在非亲和组合中表达高于亲和组合,表明TaNpsn11~13参与了小麦对条锈菌的抗性;四种外源植物激素处理后,TaNpsn11均上调表达,TaNpsn12只受水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)上调表达,而TaNpsn13被茉莉酸甲酯(MeJA)和ABA上调表达,被乙烯ETH下调表达,表明TaNpsn11~13可能是通过不同的信号途径参与小麦对条锈菌的抵抗;非生物胁迫下,TaNpsn11~13均不受到机械伤害胁迫的诱导,而对干旱和低温胁迫上调表达,并且干旱的诱导强度高于低温胁迫,对于高盐胁迫,TaNpsn11表现为抗性,而TaNpsn12、13表现为敏感;最后,成功改造适用于SNARE蛋白亚细胞定位的载体pRTL2-GFP-C1。 (3)运用电子克隆技术并通过RT-PCR验证获得了小麦TaHin1的全长cDNA;其开放阅读框642 bp,编码213个氨基酸,理论分子量23.24 KDa,等电点8.67,含信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;表达谱分析表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著;与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源SA、MeJA诱导TaHin1上调表达,ABA诱导其下调表达,而ETH不诱导其表达,表明其可能通过SA、JA信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,ABA在防御反应中起负调控作用;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调,暗示其在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。 (4)通过TIGR小麦数据库检索和RT-PCR验证,获得一条编码小麦肌动蛋白解聚因子(ADF)的全长cDNA,命名为TaAdf;其cDNA全长812 bp,其中ORF 417 bp,编码138个氨基酸,蛋白理论分子量16.10 KDa,等电点5.65;基因组序列含3个外显子,其中第一外显子仅包含起始密码子;利用中国春缺体/四体系将其定位于小麦6D染色体;洋葱表皮亚细胞定位显示其在整个细胞均有分布;原核表达蛋白大小约16 KDa,与理论值相符;表达谱分析发现TaAdf在不同组织差异表达,可能与小麦组织分化和发育相关;在与条锈菌互作中,亲和组合表达高于非亲和组合,暗示其与小麦对条锈菌的感病性相关;外源植物激素处理后,表达量主要被ABA上调,表明其可能通过调节气孔的开闭参与条锈菌对小麦的致病过程;非生物胁迫下,TaAdf对低温和干旱表现出明显抗性,对高盐和机械伤害胁迫无反应;VIGS结果显示TaAdf沉默以后,小麦对条锈菌的抗性加强。