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牛A-FABP多克隆抗血清制备及组织表达分析

季舒涵  
【摘要】: 本试验根据Genbank提供的序列设计特异性引物,以牛脂肪组织为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法对牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因进行扩增,构建该基因的原核表达载体,诱导表达此蛋白,免疫家兔制备多克隆抗血清。采用Elisa法测定所制得抗血清的效价,分别在mRNA水平和蛋白水平上对牛A-FABP的组织表达特性进行分析。使用DNAMAN、NCBI等一系列在线软件及工具对该基因序列进行生物学功能及其编码蛋白质的结构和特性等生物信息学分析。本研究为在蛋白水平上研究牛A-FABP基因的功能和深入研究此基因与肉质性状的关系奠定了基础。研究结果如下: 1、牛A-FABP基因多克隆抗血清的制备 采用RT-PCR方法扩增了牛A-FABP基因的cDNA序列,构建了牛A-FABP基因的原核表达载体。诱导表达并纯化A-FABP蛋白,免疫家兔,制备了高效价(1∶3200)的牛A-FABP多克隆抗血清。 2、牛A-FABP基因的组织表达特性分析 mRNA水平上的组织表达分析使用Real-Time PCR技术完成检测。选取心脏、肝脏、脾脏、肺、脂肪、肾脏、小肠、肌肉8种组织提取总RNA,反转录得到cDNA作为模板进行Real-Time PCR检测,分析后得知,牛A-FABP仅在脂肪组织中有高量表达。蛋白水平上的组织表达分析采用Western Blot方法完成检测。选取心脏、肝脏、脾脏、肺、脂肪、肾脏、小肠、肌肉8种组织提取总蛋白,进行Western Blot检测分析后得知,牛A-FABP仅在脂肪组织中表达,其他组织都不表达。 3、牛A-FABP基因的生物信息学分析 分析牛A-FABP序列,得知此序列的A、C、G、T四种碱基组成百分比为32%、17%、22%、29%,含有15个酶切位点,编码的蛋白质分子质量为14.7KDa,二级结构主要以α–螺旋、不规则盘绕和延伸链为结构元件,含132个氨基酸,其中强碱性氨基酸18个,强酸性氨基酸19个,疏水氨基酸45个,不带电荷的极性氨基酸32个;含有6个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个肉豆蔻酰基化位点,1个FABP结合域;含有4个Ser、6个Thr、1个Tyres,这11个氨基酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点;具有脂钙蛋白结合域,没有信号肽;无明显跨膜区,不含有二硫键。牛A-FABP基因氨基酸序列与人、鸡、小鼠、大鼠、野猪的氨基酸同源性分别为84.09%, 85.61%,71.97%, 88.33%, 81.82%,表明在进化关系上A-FABP氨基酸序列有较好的保守性。


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