绞股蓝皂苷对脊髓源神经干细胞体外培养的影响

【摘要】：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类严重的神经退行性疾病,是由外力直接或间接伤害所导致。SCI后经常产生持续性的感觉和运动功能障碍,从流行病的角度讲,永久性致残率很高。SCI的损伤区域出现神经元缺失,多数形成空洞(cavity),神经元轴突有脱髓鞘现象。还形成胶质瘢痕,进一步阻碍了患者脊髓神经干细胞所分化神经元的生长和神经系统的恢复,也对细胞移植治疗产生不利影响。SCI可以分为两个部分：一是原发性损伤,就是在受损瞬间外力对脊髓的直接伤害。包括压迫、撕裂等；二是继发性损伤,在SCI后脊髓组织缺血,引发如局部炎症、水肿以及电解质变化,细胞毒性物质(如自由基等)堆积造成缺血再灌注损伤,细胞外兴奋性氨基酸递质异常增高引起神经细胞毒作用等,这些继发改变可导致损伤范围的扩大,更多神经元的死亡,神经纤维的变性、脱髓鞘。 绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino.)为多年生蔓生草本,系葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属模式种植物。绞股蓝含有达玛烷型(dammarane)皂甙类成分,绞股蓝皂甙中的XLIII能明显增强小鼠学习记忆获得过程,使脑内的Glu水平显著提高,GABA水平明显降低,和Glu/GABA学习记忆调节系统的理论一致,该理论认为Glu对学习记忆起正性调节作用,GABA对学习记忆起负性调节作用。绞股蓝皂苷(gypenosides, Gyp)能显著增加体外培养神经干细胞向神经元分化的比例,在Gyp作用浓度为100μg/ml时,其通过提高PCNA的表达量,可显著促进体外培养的神经前体细胞(Neural progenitor cells, NPCs)的增殖。Gyp及其活性成分能缩小脑梗塞的体积,可降低缺血脑组织的自由基和兴奋性氨基酸的含量,在减轻缺血后脑水肿、增加大脑局部血流量,改善血脑屏障通透性,保护脑神经组织,抑制凋亡等方面发挥着重要作用。脊髓源神经干细胞是预诱导移植治疗脊髓损伤的最佳细胞来源之一,脊髓源神经干细胞比脑源神经干细胞分化后产生的神经元轴突长,更适合脊髓组织的修复。 本研究旨在建立小鼠脊髓神经细胞的体外培养模式,在此技术的基础上研究绞股蓝皂苷(Gyp)对神经干细胞培养体外分化的影响,尝试进行体内移植治疗脊髓损伤的初步研究。其结果如下： (1)选取新生的昆明小白鼠,从脊髓的颈段和腰荐段分离得到脊髓组织,采用机械法在体外培养。每天利用倒置显微镜观察神经细胞形态变化,并按时计数,绘制出生长曲线,对神经细胞自我更新和增值的能力进行研究。建立起一套小鼠脊髓神经干细胞的培养体系。(2)将得到的第3代脊髓神经干细胞作为后续实验的细胞来源,在培养液中分别加入不同浓度的Gyp溶液,设4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml三个浓度梯度的实验组和不添加Gyp的对照组。结果发现和不添加绞股蓝皂苷(Gyp)相比,在培养液中添加合适量的Gyp能显著的促进脊髓神经干细胞的生长,形成的细胞集落数明显增多,且集落明显变大,使得脊髓神经干细胞的培养变得更容易,对细胞的增殖有显著的促进作用。并得出添加绞股蓝皂苷Gyp浓度为20μg/ml时效果最好,这为医学上解决脊髓神经细胞培养困难提供参考和实验依据。(3)利用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达,从而对绞股蓝组和对照组培养的脊髓神经干细胞的干细胞表面抗原的表达特性进行鉴定。(4)选取添加绞股蓝培养1天、5天和10天的脊髓神经细胞,采用RT-PCR的方法研究脊髓神经干细胞各个时期的Nestin及内源性的bHLH转录因子家族的基因neruoD/ngn2和Mash-1在培养过程中mRNA表达水平的差异。在神经干细胞培养及分化过程中,Nestin在分化后的5天中持续表达,bHLH基因家族的NeuroD、Ngn2和Mash-1在第一天表达比较强烈,在第5天和第10天其表达呈下降的趋势。这表明Gyp对体外培养的神经干细胞的分化有影响作用,可以诱导其向神经元方向分化,可能启动了bHLH转录因子家族,使神经干细胞向神经元方向分化。 本研究建立了适合脊髓神经干细胞体外生长的培养体系,并对绞股蓝中的绞股蓝皂苷对脊髓神经干细胞的的影响作了较详尽的研究,实验结果表明绞股蓝皂苷能显著的促进脊髓干细胞在体外的增殖和生长,促进干细胞集落的形成,能保障脊髓干细胞在体外的增殖和分化,为医学上难以解决的脊髓神经干细胞的体外培养提供技术和实验参考。具有一定的理论和现实意义。