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辛基酚对中国林蛙精巢中P450c17(CYP17)表达的影响

杨君  
【摘要】:随着工业化的发展,环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)不断地被释放到环境中,通过饮食、接触等途径进入机体,对人类及野生生物的生存产生重大影响。辛基酚(octylphenol, OP)是一种重要的酚类环境雌激素,广泛存在于水体、土壤和日常消耗品中,其雌激素活性大约是雌二醇的10-4倍。实验已证明OP可导致精子质量和数量下降,性激素水平和性行为异常,影响雄性生育能力。细胞色素P450c17(CYP17)是类固醇合成途径中的关键酶,在精巢细胞中与睾酮的合成密切相关。有关OP干扰P450c17的研究已有报道,但有关两栖动物水域OP暴露是否影响P450c17 mRNA和蛋白的表达仍未见报道,本实验通过将雄性中国林蛙(Rana chensinensis)暴露于含OP的水体中,检测精巢Leydig细胞中P450c17 mRNA和蛋白的表达水平,探讨OP影响类固醇激素合成的机制,为酚类环境污染物的治理提供依据。 本实验将雄性中国林蛙暴露于10-6、10-7、10-8mol/LOP中10、20、30和40 d,10-7、10-8mol/L E2作为阳性对照;取其精巢,用免疫组织化学方法检测P450c17蛋白在Leydig细胞中的表达,用原位杂交和荧光实时定量的方法对CYP17 mRNA进行定位和定量分析,实验结果如下: 1.从雄性中国林蛙精巢中成功提取总RNA, OD值(260nm/280nm比值)在1.7-2.0之间。成功克隆出300bp的部分CYP17片段(序列号HQ610611),该片段序列与东北林蛙(Rana dybowskii)的相似性为97%,与粗皮蛙(Rana rugosa)的相似性为97%,与光滑爪蟾(Xenopus laevis)的相似性为96%。用所得片段序列设计合成原位杂交探针。 2.原位杂交实验结果显示,CYP17mRNA阳性反应产物主要存在于Leydig细胞中,Sertoli细胞和生精细胞中也有所表达。免疫组织化学定位检测与原位杂交结果基本一致。 3.免疫组织化学阳性反应产物的光密度检测显示:暴露10d,与对照组相比,各OP浓度组的P450c17蛋白表达差异不显著(p0.05);暴露20、30d,与对照组相比,10-6、10-7mol/LOP组的表达相对值下降显著(p0.05); 10-7、10-8mol/L OP组的表达相对值高于10-6mol/LOP组(p0.05),10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组差异不显著(p.05);暴露40d,与对照组相比,10-6、10-7mol/L OP组的表达相对值下降显著(p0.05),10-8mol/LOP组与10-7mol/LOP组比较,10-7mol/LOP组与10-6mol/LOP组比较,差异均不显著(p0.05) 比较同一OP浓度的不同暴露时间,在10-6mol/LOP处理组中,暴露20d的P450c17蛋白表达相对值低于10d,暴露30d低于20d,差异均显著(p0.05);在10-7mol/LOP处理组中,暴露20d低于10d(p0.05),暴露30d与20d差异不显著(p0.05);在10-8mol/L OP处理组中,暴露20d与10d比较,30d与20d比较差异均不显著(p0.05)。 上述显示,经OP暴露后,P450c17蛋白的表达值可发生下调,且随OP暴露浓度的升高和暴露时间的延长呈下降趋势,呈现出剂量效应和时间延长效应。暴露30d的P450c17蛋白表达值最低,暴露40d,各浓度组之间的表达差异不显著,即剂量效应被时间累积效应所减弱。 4.荧光实时定量PCR对CYP17 mRNA表达的检测显示:OP暴露10、20d,与对照组相比,各OP浓度组的CYP17 mRNA表达相对值差异极显著(p0.01),其中10-7、10-8mol/L OP组高于10-6mol/L OP组(p0.05),10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组比较差异不显著(p0.05);暴露30、40d,与对照组相比,各OP浓度组的CYP17 mRNA表达相对值差异极显著(p0.01),10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组比较,10-7mol/L OP组与10-6mol/L OP组比较差异均不显著(p0.05)。 比较同一OP浓度的不同暴露时间,在10-6mol/L OP组,暴露20d,CYP17 mRNA的表达相对值低于10d(p0.05),30d与20d的差异不显著(p0.05);在10-7、10-8mol/L OP组,暴露20d与10d比较,暴露30d与20d比较差异均不显著(p0.05) 可见OP可下调CYP17 mRNA的表达,而且随OP暴露浓度的升高和暴露时间的延长呈下降趋势,同P450c17蛋白的表达趋势基本一致。但CYP17 mRNA的表达的最低值在暴露20d到30d之间,比P450c17蛋白表达的最低值出现时间偏早。


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