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超声波提取蚕蛹蛋白及酶法制备水溶性蚕蛹多肽的生物活性研究

张研宇  
【摘要】:我国是蚕桑业生产大国,产量占世界总产量的75%,蚕蛹作为其主要副产物,数量可观。蚕蛹蛋白是一种优质的蛋白资源,氨基酸配比合理均衡,具有很高的营养价值。我国是发展中国家,居民膳食不平衡,高血压、肥胖症等饮食性疾病的发病率较高。因此充分利用原料丰富、价格低廉、天然优质的蚕蛹蛋白,开发高纯度的蛋白制品及其具有抗氧化、抑菌、降血脂等生物活性的蚕蛹多肽,具有显著的社会效益和经济效益。 本课题以蚕蛹为原料,主要从以下几个方面进行了蚕蛹蛋白的提取、水溶性蚕蛹多肽的生物活性研究,结果如下 (1)以干蚕蛹为原料,采用超声波辅助碱溶酸沉法,进行单因素及正交试验,确定其最佳提取[艺为:料液比(W/v)为12:1,pH为10,提取温度60℃,提取时间60min,超声功率为150W,在此条件下,蚕蛹蛋白提取率为49.76%,得率为36.32%;冷冻干燥后得到蚕蛹蛋白粉,测定其蛋白质的含量为94.56%;研究蚕蛹蛋白粉的脱色、脱臭工艺,结果表明,无水乙醇具有较好的脱色、脱臭作用,得到浅灰色、无臭、略有蚕蛹味的蚕蛹蛋白粉。 (2)选取Alkaline proteinase, Flavourzyme, Compound proteinase, Trypsin, Papain,中性蛋白酶6种蛋白酶,研究单酶及双酶复合制备水溶性蚕蛹多肽的工艺。单酶水解工艺中,Alkaline proteinase的水解度最高为25.28%,且稳定性最好,为最佳蚕蛹蛋白水解单酶;双酶水解工艺中,Ⅰ组合(Alkaline proteinase与Flavourzyme)的水解度最高,达到28.13%,并且双酶组合后水解度及酶的稳定性均比单酶有所提高。 (3)对于各种单酶组(A、B、C、D、E、K)及双酶组(F、G、H、I、J)所制备的水溶性蚕蛹多肽进行DPPH清除能力的研究,以BHT作为对照,结果表明,清除能力大于BHT的6种水解产物中,单酶组均比双酶组制备的蚕蛹多肽的清除能力强,其中B组的清除率最高为92.43%。 (4)对于各种单酶组及双酶组所制备的水溶性蚕蛹多肽进行ACE抑制活性研究,结果表明,G组(Alkaline proteinase与Compound proteinase)所制备的多肽的ACE抑制效果最强,为85.93%;双酶组的抑制效果比单酶组的好。 (5)对各种单酶组及双酶组所制备的水溶性蚕蛹多肽进行氨基酸组成分析,结果表明,Ⅰ组制备多肽的氨基酸含量最高,达到60.54%,G组次之,为60.17%;除H组外,双酶水解组所得多肽的氨基酸总含量均高于单酶组,并且所测各种氨基酸的含量也较单酶组高;双酶组多肽中芳香族及疏水氨基酸的含量(除H组外)均大于单酶组,其中,Ⅰ组最高,达到27.13%,G组次之,为26.95%。 (6)选取ACE抑制活性最强,且清除DPPH能力也较好的G组(Alkaline proteinase与Compound proteinase)制备的水溶性蚕蛹多肽,以多肽得率为指标,进行单因素及正交试验,得到最优水解工艺为:pH为8,水解温度60℃,水解时间3.5 h,在此工艺条件下,水溶性蚕蛹多肽得率为77.56%。 (7)对G组(Alkaline proteinase与Compound proteinase)制备的水溶性蚕蛹多肽进行超滤分离,得到7级不同分子量段的水溶性蚕蛹多肽,对其分别进行DPPH清除能力、ACE抑制活性研究。DPPH清除能力的研究结果表明,分子量小于1000 Da的多肽清除自由基能力最强,为87.17%,大于对照组。ACE抑制活性的研究结果表明,分子量1000-5000 Da之间的多肽的ACE抑制活性最强,达到86.53%,高于G组超滤之前。对ACE抑制活性最好的分子量段(1000-5000 Da)的多肽进行氨基酸分析,结果表明,氨基酸含量为65.07%,芳香族及疏水氨基酸含量为32.16%,均高于G组超滤之前。 (8)采用Sephadex G-25凝胶过滤层析纯化分子量为1000-5000 Da的水溶性蚕蛹多肽,并进行ACE抑制活性的研究以及分子量分析。结果表明,分子量在1560 Da附近的水溶性蚕蛹多肽的ACE抑制活性较高,为86.27%,接近分子量1000-5000 Da的多肽在纯化前的抑制率(86.53%)。 (9)采用RP-HPLC分析水溶性蚕蛹多肽的纯化效果。结果表明,分子量为1000-5000 Da的水溶性蚕蛹多肽经过SephadexG-25凝胶过滤层析纯化后,纯度得到明显提高。


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