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细胞与亚细胞层面上对稳恒磁场—抗癌药物联合效应的AFM研究

刘颖  
【摘要】:目的:研究稳恒磁场-抗癌药物的联合效应在细胞及亚细胞层面上的形态学影响,建立大气与生理溶液环境下的细胞原子力显微镜观测系统,并利用该观测系统观察曝磁作用下各种不同肿瘤细胞表面形态的变化,随着研究的深入,将磁场-抗癌药物的联合效应从细胞层次上进一步深入到亚细胞层次,观察磁场联合抗肿瘤药物对DNA分子形态的影响,期望可以研究稳恒磁场-抗癌药物联合效应的可能机制。 方法:通过原子力显微镜观察不同浓度,不同类型的固定剂对细胞表面形貌的影响,针对不同的细胞筛选出合适的固定剂类型及最佳浓度,同时改变原子力显微镜的扫描模式,扫描频率等相关参数,并对观察结果进行分析,从而优化原子力显微镜观测系统。使用优化后的AFM观测系统观察磁场,肿瘤药物,磁场联合肿瘤药物对肿瘤细胞表面精细结构的影响,并对结果进行分析。建立DNA观测系统,研究顺铂联合磁场对细胞DNA分子的形态学影响。 结果: 1.获得大气及溶液环境下AFM观测细胞的最佳参数,并借助该系统观察了不同类型的固定细胞与活细胞的表面形态,在大气观测环境中获得了小鼠原代肝细胞,K562细胞,SW480细胞,Hepa1-6小鼠肝癌细胞,红细胞的AFM图像,在生理溶液环境中实时观察到SW480细胞,SMMC-7721细胞,小鼠肝细胞等贴壁细胞的活细胞AFM图像。 2.通过观察不同曝磁时间下的细胞表面形态的区别,发现原子力显微镜可以在细胞活性降低前就观察到磁场对细胞的磁致损伤。结果表明AFM是一种对磁致损伤既简单又相当灵敏的检测手段。通过观察发现,磁场可以使细胞表面产生孔洞,肿瘤细胞比正常细胞对磁场的敏感性更高,而悬浮生长的肿瘤细胞比贴壁生长的肿瘤细胞的磁致损伤敏感性更大,实验结果表明正常细胞对磁场有更强的抗性。 3.原子力显微镜观察结果表明磁场对K562细胞表面有损伤效应,为了进一步研究其作用机制,利用原子力显微镜观察了同步化的K562细胞在不同周期时相中细胞的表面形貌,以排除细胞周期改变对磁场效应研究的影响。 4.不同的抗癌药物与磁场联合作用后的效应不同,紫杉醇,环磷酰胺与磁场的联合效应是一种加合作用,而顺铂和阿霉素与磁场的联合效应则显示出协同作用。 5.DNA的溶液浓度对成像质量有非常重要的影响,经过实验表明要想清晰的观测到DNA的微观结构应稀释DNA样品至0.03μg/ml左右,在稀释时避免操作不当引起的DNA断裂。 6.在DNA实验系统的建立过程中,利用AFM观察了UV造成的细胞DNA损伤,实验表明UVB/UVC对K562细胞DNA的影响呈现时间/剂量依赖效应,但两种UV处理的结果又有所区别,UVB的短时照射会导致DNA链的断裂,时间延长后DNA链的交联就会出现。与UVB相比,UVC对K562细胞DNA的损伤更大,短时间照射就会致使DNA链发生断裂和交联,随着辐射时间的延长,DNA交联加剧;长时间辐射会产生大量的交联及断裂,同时发生DNA链的凝缩和缠绕等结构性破坏。 7.对琼脂糖凝胶去除后的彗星整体结构进行了AFM观察,实验发现彗星头部DNA(胞核中保留的DNA)存在形式是聚集块状,而尾部DNA则是网状结构,稀释后发现彗星尾部结构主要是断裂和交联的DNA构成。实验观察结果证明了前人对彗星尾部结构以DNA断片或loop环形结构存在的推测。 8.通过对曝磁后K562细胞DNA观测发现K562细胞连续曝磁12小时之后,其DNA链增粗,并伴有少量的链间交联;顺铂处理K562细胞12小时后,细胞DNA发生断裂,部分DNA链发生扭曲,并形成串珠样结构;磁场结合顺铂处理K562细胞12小时后,DNA发生严重断裂,DNA链发生交联,同时伴有缠绕凝结,DNA损伤非常严重;AFM的观察结果表明,顺铂与磁场的联合作用对K562细胞DNA存在极强的协同损伤效应。 结论:原子力显微镜细胞样品的制备相对与其它观测手段具有简单方便的特征,但其对固定剂的种类,浓度及操作者的操作规范性要求较高。选择合适类型的固定剂及浓度可以最大限度保存细胞精细结构,使其更接近活细胞形态。细胞的损伤随曝磁时间的延长而加剧,悬浮细胞表面比贴壁细胞更容易被磁场损伤,正常细胞比肿瘤细胞对磁场有更强的抗性。磁场结合抗癌药物对细胞表面的影响随药物类型的改变而有所不同,有些呈现加合效应,有些则是协同效应。合适的DNA浓度是原子力显微镜成功观察DNA精细结构的必要条件,利用UV对细胞DNA损伤的阳性模型建立原子力显微镜观察DNA交联和断裂的实验系统,实验表明AFM观测是研究DNA交联和断裂比较灵敏和简单的方法。首次用原子力显微镜观察了彗星电泳中“彗星”DNA的结构,发现它的头部就是聚集成块状的DNA,而尾部则由交织成网状的DNA构成。顺铂结合磁场导致了K562细胞DNA的形态学变化,该变化表明二者对细胞DNA有协同杀伤的效果。


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