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过氧化物模拟酶信号放大无标记DNA荧光检测方法的研究

薄红艳  
【摘要】:DNA是储存遗传信息的双螺旋大分子,它携带着人类及其他生物的遗传信息,指导各类型蛋白质的合成。根据已知的基因片段来确定与检测序列有关的疾病,对受检者的DNA序列进行测定和定位分析的基因测序显得尤为重要。目前,DNA序列的测定方法有很多种,传统的DNA测序方法一般采用凝胶电泳法,近十多年来,光学方法由于其非破坏性和高灵敏度成为最成熟的DNA检测技术。其中荧光法以其灵敏度高而广泛用于DNA检测。本论文由以下三部分组成。 第1章绪论 本章介绍分子信标的结构和原理,重点概述分子信标特点,G-quadruplex结构及其应用。同时介绍模拟酶概念和理论设计,过氧化物模拟酶简介以及应用。最后阐述本论文的选题背景,研究意义,研究目的及研究内容。 第2章过氧化物模拟酶信号放大无标记DNA荧光检测方法的研究 本章构建了一种非标记荧光增强型检测目标DNA的方法。这种新型的非标记分子信标由茎环结构的发卡型DNA探针和外源荧光染料10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪(ADHP)组成。这种新型分子信标其茎部为富含G碱基的DNA寡核苷酸序列,与分子信标另一茎状部分互补配对。当有目标DNA存在时,这种富含G碱基的DNA序列可以从分子信标的茎环结构中解离出来,在K+存在下,形成K+稳定的G-quadruplex,与氯化血红素(Hemin)作用后,形成G-quadruplex-Hemin复合物,表现出过氧化物酶的活性,催化ADHP-H2O2反应。ADHP本身不发荧光,G-quadrupl ex-Hemin复合物催化H202分解的同时,将ADHP氧化,其氧化产物可以发荧光。通过检测荧光信号,可以间接检测目标DNA。基于G-quadruplex-Hemin复合物的模拟酶具有酶活性,随着催化时间延长产物大量积累,因而有效的放大了荧光信号提高了检测灵敏度。研究发现,当加入含单碱基错配的目标DNA时,荧光信号明显弱于全匹配的DNA,表明非标记荧光分子信标可以用于区分完全互补链和单碱基错配。实验证明目标DNA在(1×10-11-1×10-8mol/L)表现出一定的线性关系。线性回归方程为1=2.0c(n mol/L)+33.6,检出限为3.0×10-12mol/L,相对标准偏差R2=0.994。我们所设计的新型非标记分子信标可以用于高灵敏检测目标DNA。 第3章基于过氧化物模拟酶光度法检测葡萄糖 本章利用富含G碱基的DNA在在氯化血红素和K+存在下,形成K+稳定的G-quadruplex,能够表现出过氧化物酶活性。葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下,生成葡萄糖酸和H2O2。该过氧化物模拟酶在催化H2O2分解的同时,将底物ADHP由无色变成其的氧化产物为有色物质,随着葡萄糖的增加,其紫外—可见吸光度也增加,实现了光度法检测葡萄糖。本文利用双酶体系有效放大信号,提高了检测灵敏度。该比色分析法响应速度快,所用仪器设备简单。在优化实验条件下,实验证明葡萄糖在(10-100umol/L)表现出一定的线性关系。线性回归方程为A=0.003c (umol/L)+0.046,检出限为30×10-6mol/L,相对标准偏差R2=0.998。我们所设计的新型分子探针可以用于高灵敏检测葡萄糖。


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