淫羊藿黄酮类化合物活性物质的体外模型筛选及抗氧化研究

【摘要】：本论文从化学成分和细胞生物学层面分析了中药淫羊藿黄酮类化合物中的活性成分,建立了体外氧化应激模型和血脑屏障模型,利用模型对淫羊藿黄酮类化合物进行筛选,并对筛选出的活性成分进行分析、鉴定和体外抗氧化研究,为与心血管疾病和中枢神经系统疾病相关的药物筛选提供了新的研究思路。 本论文的主要研究内容有： 1.体外氧化应激筛选模型的建立并应用该模型从淫羊藿黄酮类化合物中筛选活性成分 以筛选活性化合物为目的,建立了从中药中筛选与心血管疾病相关的活性化合物的体外氧化应激模型。该方法是利用中药中活性成分与氧化损伤人脐静脉内皮细胞上的效应靶点特异性结合的特性,使中药提取物与内皮细胞相互作用,活性成分与之结合,未结合的成分被洗掉。再通过细胞膜受体失活的方式,使与细胞受体特异性结合的成分解离下来,应用液相-质谱联用技术分析鉴定筛选出的活性成分。将该模型应用于淫羊藿黄酮类化合物中,筛选与心血管疾病相关的活性成分。研究结果表明,淫羊藿黄酮类化合物中至少有6种活性成分能与人脐静脉内皮细胞受体特异性结合,其中3种活性成分被鉴定分别为朝藿定B、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ。 2.体外血脑屏障筛选模型的建立并应用该模型从淫羊藿黄酮类化合物中筛选活性成分 中枢神经系统对外界相对封闭,具有免受多种物质影响的独特结构,致使许多药物不能进入中枢神经系统发挥作用,利用体外血脑屏障模型可筛选出能够作用于中枢神经系统的活性物质。本论文利用ECV304/C6细胞共培养模式来模拟在体血脑屏障建立药物筛选模型,通过跨膜电阻和小分子物质渗透率分析证明,ECV304细胞在C6细胞诱导下所建模型具有体内血脑屏障的特点。应用所建血脑屏障模型,从淫羊藿黄酮类化合物中筛选出能够通过血脑屏障的活性成分,并进-步利用液相-质谱联用技术对筛选出来的药物进行分析和鉴定。研究结果表明,淫羊藿黄酮类化合物中至少有2种化合物能够通过血脑屏障,它们分别是淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ。 3.淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的体外抗氧化研究 淫羊藿苷是淫羊藿中主要的活性成分,属于黄酮类化合物,具有保护心血管系统、调节免疫、抗癌、抗骨质疏松和改善性功能紊乱等多种重要的生物活性。淫羊藿次苷Ⅱ是淫羊藿苷的代谢产物,对其功能知之甚少。本实验建立了体外自由基发生体系：DPPH?、NBT-NADH-PMS, OH?、卵黄脂质过氧化模型反应体系、还原铁氰化钾以及β-胡萝卜素-亚油酸自氧化体系分别测定了淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对DPPH?、 O2-?、 OH三种自由基的清除能力,它们对脂质过氧化的抑制能力,还原力以及总抗氧化能力,以此来研究待测样品淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的体外抗氧化活性,并以BHT和Vc作为阳性对照。 实验结果表明,淫羊藿苷具有很强的清除DPPH?、 O2-?、还原能力和总抗氧化的能力,有较强的清除OH·的能力,且均呈剂量依赖性。淫羊藿次苷Ⅱ对DPPH的清除能力很强,在清除OH·,02-·和抑制脂质过氧化方面也有较强的作用。淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ抗氧化效果在一定范围内与其浓度呈正相关,即随着浓度的升高,抗氧化能力逐渐增强。但当抑制率或清除率达到一定水平时,剂量的加大对其抗氧化效果影响不大。淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对同一种自由基的清除能力也不相同。究其原因可能是因为两者酚羟基数目、所处位置和糖基的数目、所处位置的不同。本实验的研究结果对于阐明淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ药理活性的作用机制具有一定的参考价值,为潜在抗氧化剂的开发和利用奠定实验基础。