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基于RNA-Seq对Byssochlamys nivea FF1-2降解棒曲霉素的生物信息学分析

赵刚  
【摘要】:棒曲霉素(patulin,PAT)是一种对人类健康造成极大威胁的真菌毒素,普遍存在于水果及其制品中,在苹果及其制品中的污染尤为严重。利用微生物法降解棒曲霉素以其经济、安全、高效等优点,前景广阔。在过去的研究中,本研究室首次筛选并鉴定出雪白丝衣霉属中可以高效降解棒曲霉素的菌株——雪白丝衣霉(Byssochlamys nivea)FF1-2,并对其降解特性进行了相关探究。然而,有关B.niveaFF1-2降解棒曲霉素的机制问题尚未明确,这严重制约了其在苹果加工工业中对棒曲霉素控制及降解方面的应用。为了解决这种现状,本研究利用RNA-Seq技术对降解棒曲霉素不同时间的B.nivea FF1-2进行转录组深度测序及denovo组装,构建了 B.niveaFF1-2的转录组数据,以此为基础,通过比对包括NR、Swiss-Prot、GO、KOG及KEGG在内的公共蛋白数据库得到相关功能分类注释和代谢通路分析;通过不同组别差异表达基因分析,初步筛选出了与降解棒曲霉素可能相关的差异表达基因并对B.nivea FF1-2降解棒曲霉素的机制进行了浅析;此外,本研究还利用MISA对获得的B.niveaFF1-2转录数据进行了简单重复序列位点识别。主要的研究结果如下:1)采用Illmuina HiseqTM 2500测序平台对降解棒曲霉素不同时间的B.nivea FF1-2 RNA样本进行双末端测序。共计获得了约271.22 M个clean reads,de novo拼接共得到了 27,214条unigenes,其中总长为36,019,203 bp,N50值为2722 bp。将所得的所有unigenes与公共蛋白数据库NR、Swiss-Prot、GO,KOG及KEGG进行比对注释,22,075条,即81.12%的unigenes至少在一个数据库中得到功能注释。所有unigenes中,共有12,900条unigenes与KOG数据库具有基因同源性,依据预测功能的差异被划归到25个类别;GO功能分类将15,498条unigenes(56.95%)注释到63个条目之中;5364条unigenes被注释到215个KEGG代谢通路之中。这些unigenes主要涉及代谢过程、信号传导及部分细胞成分相关的过程。2)以|log2(FC)|1且FDR ≤ 0.05为阈值,对降解不同棒曲霉素程度的B.nivea FF1-2转录组进行差异表达分析,其中Ck vs.D3有1680个差异表达unigenes,其中包括1025个上调,655个下调表达unigenes;Ck vs.D5有1454个,其中上调和下调unigenes分别为894和560个;D3 vs.D5组总共有2247个,上调表达unigenes为1228个,下调表达unigenes为1019个。3)对差异表达unigenes进行GO和KEGG pathway富集分析发现,差异表达unigenes主要参与氧化还原酶活性及甲基转移酶活性、生物素代谢、细胞色素P450参与的外源物质代谢等生物过程。4)使用M][SA软件在27,214条unigenes中共搜索到75种,3909个简单重复序列(SSR),其出现的频率为14.36%。在所有SSRs中,3040条unigenes可利用Primer 3成功设计引物,成功率为82.27%。以本研究获得的B.nivea FF1-2转录组数据为基础,结合前人对微生物降解棒曲霉素的研究,笔者对B.nivea FF1-2降解棒曲霉素的分子机理进行了探究讨论,而有关B.niveaa FF1-2系统完整的降解棒曲霉素机理还有待于后续试验的验证。本研究首次利用第二代测序技术及生物信息学分析方法探究B.nive a FF1-2降解毒素的分子机制,为尽快厘清微生物降解毒素的机理问题提供了可参考的案例,也为尽早使用该菌株解决苹果加工产业毒素污染的问题提供了可能。


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