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山茱萸总皂苷提取工艺及改善糖尿病相关机制研究

王红菊  
【摘要】:山茱萸(Cornus officinalis Sieb.etZucc.)为山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus)多年生木本植物,主产于我国浙江、河南、陕西、安徽等地,以人工栽培为主。其干燥成熟果肉可入药,具补肝益肾、涩精固脱、内热消渴等功效,广泛应用于中成药配方及中医临床。研究表明,皂苷是山茱萸的重要生物活性成分之一,具有调节免疫、保护肝脏、抗心律失常、治疗糖尿病及其并发症等作用,但其对糖尿病改善的相关机制缺乏系统的研究,限制了山茱萸在糖尿病方面的开发与利用。本研究首先通过响应面法优化了山茱萸总皂苷超声-微波协同提取工艺,并经HPD-300型大孔树脂分离纯化,达到提高产率的目的;其次探讨了不同产地山茱萸总皂苷含量的地理变异,考察其与不同地理因子之间的变异关系,发现产地影响显著;最后通过高脂高糖饮食联合注射低剂量STZ建立2型糖尿病模型,考察不同剂量总皂苷对糖尿病小鼠糖代谢的影响,并从脂代谢、肝脏炎症、氧化应激和骨骼肌胰岛素信号通路关键靶基因mRNA表达等方面探讨了山茱萸总皂苷改善2型糖尿病可能的机制,为山茱萸总皂苷在糖尿病防治方面提供理论依据与数据支撑。本实验的主要结果如下:(1)响应面法优化山茱萸总皂苷超声-微波协同提取工艺,最佳工艺参数为:料液比1:21,微波功率417 W,超声功率369 W,提取时间5 min,较超声辅助法和微波辅助法相比,提取率分别提高了 28.43%、24.98%。(2)HPD-300型大孔树脂富集纯化山茱萸总皂苷各工艺参数分别为:吸附条件:上样液浓度3.5 mg/mL,上样流速2 BV/h,上样液pH为7.0,最大上样量6 BV;洗脱条件:洗脱剂50%乙醇溶液,洗脱体积8.5 BV(先用3 BV蒸馏水洗脱,再用3.5 BV50%乙醇洗脱),洗脱速度1.5 mL/min。山茱萸总皂苷纯度由6.23%提升到37.36%,较原来纯度提高了 6倍。(3)不同产地山茱萸总皂苷含量的地理变异分析,结果表明15个产地间山茱萸总皂苷含量差异显著,其中河南西峡、陕西佛坪两地含量在所选产地中最高,分别为26.65 mg/g和25.80 mg/g,安徽石台为13.55 mg/g,含量最低;总皂苷含量与产地海拔呈极显著的正相关,与经度呈显著负相关;聚类分析表明,东西部产地总皂苷含量差异明显,总体呈现出西高东低的变异趋势。(4)山茱萸总皂苷动物实验结果表明:在糖代谢及胰腺病理学方面,山茱萸总皂苷能显著降低2型糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)和胰岛素抵抗指数(IRI),改善糖耐量,增加胰岛素分泌及敏感性,保护胰岛细胞不受损害,其机制可能与改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗,保护胰岛功能有关;在脂代谢及肝脏病理学方面,山茱萸总皂苷能显著改善糖尿病小鼠的血脂指标(TG、TC、HDL-C、LDL-C),保护肝脏功能,其机制是通过改善“脂毒性”来缓解胰岛素抵抗作用;在炎症及氧化应激方面,山茱萸总皂苷能显著降低糖尿病小鼠肝脏组织炎症因子(IL-6、TNF-α、CRP)含量,增加SOD活性,其作用主要是通过抵抗炎症和减少氧化应激来改善肝脏胰岛素抵抗;在关键靶基因表达方面,山茱萸总皂苷能显著上调糖尿病小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI-3K、AKT基因mRNA的表达,促进骨骼肌对葡萄糖的利用,也是其改善糖尿病小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的机制之一。以上效果在一定程度上均呈现剂量依赖性。


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