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有氧运动与LIPUS联合对模拟失重大鼠腓肠肌的影响及分子代谢机制研究

张之豪  
【摘要】:目的:在太空中,宇航员经过中长期的飞行,会使其的生理系统发生变化,主要表现为运动能力减退,引起肌肉萎缩、骨质流失等。其中肌肉萎缩表现得最为突出,此结果会严重影响航天员飞行中的身体健康和工作能力以及返回地面后的再适应能力。而科学的体育运动则可以预防肌肉萎缩,并且对肌肉质量、面积、肌力都有较好的改善作用,有针对性的运动方式对骨骼肌有更加积极影响,如有氧耐力运动,而其作用机制也一直是研究的热点。低强度脉冲超声(Low-intensity pulse ultrasound,LIPUS)是一种安全有效且便捷的治疗手段,有研究表明LIPUS对肌肉组织具有生物效应,能改善肌肉损伤,促进细胞的增殖分化和蛋白质的合成,具有一定的探究空间和价值。而采用运动联合低强度脉冲超声双重干预手段在航空领域对抗以及治疗肌肉萎缩相关研究甚少。因此本实验建立大鼠尾吊失重性肌萎缩模型,采用有氧运动和低强度脉冲超声以及二者联合干预手段,从蛋白、组织学等角度去研究不同干预手段对模拟失重大鼠腓肠肌肌萎缩的影响以及相关机制研究。此外利用代谢组学分析技术检测分析悬尾大鼠在运动、超声及两者联合的七种干预途径干预后,所致的内源性标志代谢物改变,还有与之有关的差异代谢途径。分析对抗和治疗失重所导致的肌肉萎缩的有效方法及其作用机制,为在太空失重情况下所导致的肌肉萎缩的恢复提供可靠依据及指导作用。方法:本研究的实验对象为体重在180-200 g健康纯系雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠72只。随机分为正常对照组(NC,n=8)、模型对照组(MC,n=8)、高声强超声组(HLS+80mW/cm~2,n=8)、高低声强联合超声组(HLS+30/80mW/cm~2,n=8)、低声强超声组(HLS+30mW/cm~2,n=8)、高声强联合运动组(HLS-E+80mW/cm~2,n=8)、高低声强超声联合运动组(HLS-E+30/80mW/cm~2,n=8)、低声强超声联合运动组(HLS-E+30mW/cm~2,n=8)和运动组(EC,n=8)九个组别,适应性喂养一周后,除正常对照组外均进行为期28 d的尾吊。超声组使用LIPUS仪进行超声诊治,超声治疗仪参数分别为30 mW/cm~2和80mW/cm~2,中心频率1.5 MHz,占空比为20%,治疗时间20min,每周治疗7d,持续4w超声治疗直至尾吊结束。运动组大鼠适应性运动1w后接着进行正式有氧运动,跑台速率设置为24m/min,每组时间为40min,运动总周期为4w,每周运动7d。运动联合不同声强超声组均采用以上超声以及运动参数。28d时,对各组大鼠进行取材,检测各组大鼠血清CK和LDH等生化指标,使用HE染色对大鼠腓肠肌进行形态学方面的分析。运用Western Blot从蛋白水平对MSTN/Akt通路上的各关键信号分子进行分析,探讨有氧运动和低强度脉冲超声对失重导致的腓肠肌萎缩的影响及生物学机制。运用气相色谱—质谱联用(GC-MC)技术对运动、超声及运动联合超声干预后的大鼠血液进行测定分析,借助诸多不同数据统计手段(以主成分分析法、正交偏最小二乘法为主),对潜在的差异代谢物进行挖掘,借助京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库,来鉴定所筛选出的生物标志物,接着把其录入至数据库MetPA内,对此类生物标志物相关代谢通路进行分析。结果:1.根据腓肠肌湿重结果显示,28d,与NC组相比,其他组的腓肠肌湿重均有极显著下降(P0.01),HLS-E+30mW/cm~2组与MC组有显著差异(P0.05)。2.腓肠肌肌张力显示,28d时MC组与NC组比较,肌张力极显著下降(P0.01),EC组、HLS+80mW/cm~2组和HLS-E+30mW/cm~2组肌张力与MC组相比有显著提高(P0.05)。3.大鼠血清的生化指标检测结果显示,通过28d的运动及超声干预,HLS+30mW/cm~2组的血清CK活性与HLS+30mW/cm~2组和MC组相比显著增高(P0.01),HLS+30/80mW/cm~2 组的血清 CK 与 MC 组、NC 组、HLS+30mW/cm~2组相比有显著降低;而HLS+30/80mW/cm~2组的血清LDH活性与MC组、NC组、HLS-E+30mW/cm~2组以及EC组相比显著降低(P0.01)。4.通过HE染色对大鼠腓肠肌形态学指标检测结果显示,与MC组对比,NC、HLS+30/80mW/cm~2、HLS+80mW/cm~2、EC、HLS-E+30mW/cm~2、HLS-E+30/80mW/cm~2和HLS-E+80mW/cm~2组肌纤维平均横截面积增加,并存在极显著差异(P0.01)。5.WB结果显示悬尾大鼠腓肠肌中MSTN,与NC组相比,其他各组的腓肠肌MSTN蛋白表达水平均显著增高(P0.01);与MC组相比,HLS+30/80mW/cm~2、HLS+30mW/cm~2、HLS-E+80mW/cm~2 组均显著增加;而 HLS+80mW/cm~2、HLS-E+30/80mW/cm~2和运动组相较于HLS+30mW/cm~2组有显著差异且呈降低趋势。而MSTN受体Act ⅡB的蛋白水平检测结果显示,与NC组和MC组相比,HLS+30mW/cm~2、HLS+30/80mW/cm~2、HLS+80mW/cm~2、HLS-E+30mW/cm~2、和 EC组都显著降低(P0.01);和 HLS-E+30mW/cm~2 组相比,HLS-E+80mW/cm~2、HLS-E+30/80mW/cm~2组的蛋白表达量呈显著上升。悬尾大鼠腓肠肌的Akt蛋白表达量:与MC组相比,除HLS+80mW/cm~2组外,其余各组均有显著升高;HLS+30/80mW/cm~2 和 HLS-E+30mW/cm~2 组显著高于 HLS+80mW/cm~2 组的蛋白表达量,而Akt的下游分子mTOR的趋势与Akt完全一致。提示干预手段除了声强80mW/cm~2的超声外均有效增加了 Akt和mTOR的蛋白表达量。6.NC组与MC组大鼠、EC组与MC组大鼠对比有共同的两条显著的代谢差异同通路,其一为亚油酸代谢通路,其二为苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)的生物合成。运动干预以及肌肉萎缩同代谢中间产物亚油酸和酪氨酸的水平改变有直接联系;30/80mW/cm~2声强与80mW/cm~2两种声强干预时,存在相同的潜在的5条代谢靶标途径,分别为①丙氨酸、谷氨酸(glu)与天冬氨酸(Asp)代谢;②亚油酸代谢;③Phe、Tyr与Try的生物合成;④甘油脂代谢;⑤甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)与苏氨酸(Thr)的代谢。而30mW/cm~2声强干预下的代谢靶标通路为丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢;NC组与HLS-E+30mW/cm~2组对比,分析得到3条代谢途径,分别为亚油酸代谢途径;甘油脂代谢途径;Phe、Tyr与Try的生物合成。NC组与HLS-E+30/80mW/cm~2组对比,分析得到5条差异代谢通路,分别为①Phe、Tyr与Try的生物合成;②甘油脂代谢;③Gly、Ser与Thr的代谢;④乙醛酸与二羧酸的代谢;⑤丙氨酸、Asp与glu的代谢。NC组与HLS-E+80mW/cm~2组对比,分析得到3条代谢途径,其一为亚油酸代谢途径;其二为Phe、Tyr与Try的生物合成途径;其三为Gly、Ser与Thr的代谢。结论:1.有氧运动和三种不同声强超声均可有效对抗悬尾所导致的大鼠腓肠肌萎缩。2.三种不同声强的超声中,80mW/cm~2声强超声改善肌张力效果优于30mW/cm~2声强和30/80mW/cm~2声强的超声;运动和超声联合均能不同程度的改善失重性萎缩。3.运动和超声改善失重性大鼠腓肠肌肌萎缩的分子机制可能与胞内信号分子Akt及下游合成蛋白的信号分子mTOR表达增加有关。4.通过代谢组学可知,腓肠肌肌萎缩和运动对抗肌萎缩主要靠调节亚油酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成通路,主要与亚油酸和酪氨酸的变化有着密切的关系,提示这两个代谢产物可以作为失重性肌萎缩的诊断与治疗的检测指标进行靶向的检测。


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