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84K杨组织培养及基因转化的研究

赵清爽  
【摘要】: 以84K杨叶片为材料建立了组织培养及植株再生系统,对影响84K杨植株再生和超度含水态苗形成的一些因素进行了探讨,并在此基础上开展了HVA1基因转化84K杨的研究。 (一)84K杨组织培养及植株再生系统的建立 以84K杨叶片为材料研究了不同种类及浓度的植物激素对其脱分化及再分化的影响。结果显示,84K杨叶片在MS附加ZT 0.5mg/L、2,4-D 0.5mg/L、IAA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L的培养基上培养7d就可以形成愈伤组织,在MS附加ZT 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的培养基上,15d可诱导形成不定芽,其诱导率达到100%,且每个叶片外植体上可形成10-20个不定芽。当不定芽长到2-3cm时,将其切下,转入1/2MS附加IBA 0.2 mg/L的生根培养基上,培养10d后即可获得完整的再生植株。 (二)84K杨试管苗超度含水态现象的研究 84K杨组织培养过程中出现了一定量的超度含水态苗。为了减少超度含水态苗的出现,本实验研究了不同激素浓度、扦插不定芽数、蔗糖浓度、琼脂浓度、大量元素浓度等5种因素对84K杨超度含水态苗形成的影响。结果表明随着琼脂浓度的增加超度含水态苗明显减少,同时考虑增殖率与超度含水态率,84K杨组织培养增殖培养基中琼脂的适宜浓度以7g/L较好;对于扦插不定芽数而言,随着扦插不定芽数的增多,超度含水态率大大增加,为减少超度含水态苗的出现,每个培养瓶中以接种2个不定芽为好;6-BA和NAA浓度变化对84K杨超度含水态苗的形成无显著影响,但对84K杨不定芽增殖的影响显著;高浓度蔗糖可以防止超度含水态现象的发生,但蔗糖浓度过高影响不定芽的增殖,防碍84K杨试管苗的正常生长;培养基中大量元素的用量对超度含水态苗的发生也有一定的影响,随着大量元素用量的增加,超度含水态发生频率也有所增加,大量元素浓度过高过低都不利于84K杨试管苗的正常生长。在既要获得大量再生植株又要降低84K杨超度含水态现象发生的前提下,84K杨不定芽增殖的适宜培养基为MS附加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L,3%蔗糖,琼脂7g/L,每瓶接种2个不定芽。 (三)抗旱相关基因(HVA1)转化84K杨的研究 选用84K杨叶片作为转化受体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将HVA1基因导入84K杨,获得了抗卡那霉素表型的再生植株。对菌液浓度、浸染时间、共培养时间,以及抗菌素种类和浓度进行了筛选,结果显示:当菌液浓度OD_(600)为0.4-0.6 时,将其用MS倍稀释液重悬,浸染10-15min,共培养2-3d,选择培养基中头 抱曲松钠浓度为200mg几,卡那霉素30mg/L是84K杨基因转化及再生植株获得的 较好条件。 84K杨叶片良好的植株再生系统的建立以及在此基础上开展的HVAI基因转化 84K杨的研究不仅可为进一步研究84K杨的发育生理、细胞分化以及形态建成等许 多基础理论问题提供新的实验系统,而且为利用现代生物技术改良杨树品种、加 速育种进程、促进优良种苗的快速繁殖与利用等奠定了基础。


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