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鲤鱼抗菌精蛋白的提取、分离、抗菌特性研究及抗菌机理探讨

上官新晨  
【摘要】:本文以我国主要的淡水鱼类鲤鱼的废弃物——精巢为原料,采用现代提取、分离纯化技术,对精巢的抗菌精蛋白的提取、纯化及抗菌特性进行了系统的研究。同时,对鲤鱼抗菌精蛋白抑菌机理进行了探讨。为鲤鱼抗菌精蛋白的开发以及作为天然食品防腐剂的应用提供了理论基础。主要获得如下结果: 不同鲤鱼品种和不同精巢发育期对鲤鱼抗菌精蛋白的影响研究表明:采用同一发育期不同品种鲤鱼的精巢为原料提取抗菌精蛋白,其得率及其抑菌活性没有显著差异;采用同一品种不同发育期的鲤鱼精巢为原料提取的抗菌精蛋白,其得率及其抗菌活性有显著差异,以第Ⅴ期为最高(得率及其抗菌活性分别为4.63%和84.5%)。 本试验通过对硫酸浓度、提取温度、提取时间、以及蛋白质沉淀剂的选择等优化试验,获得了科学、实用、蛋白质得率高、抗菌活性较好的鲤鱼抗菌精蛋白提取工艺路线。主要工艺条件为:每1g鲤鱼精巢用4mL7.5%浓度的硫酸溶液,温度为10℃,提取时间2h,然后每1mL硫酸提取液用三倍体积95%的冷乙醇沉淀析出抗菌精蛋白。 本文首次探讨了超声波技术用于鲤鱼抗菌精蛋白的提取,试验结果表明:采用超声波可以大大缩短提取时间,降低硫酸浓度。采用1.0A强度的超声波可将硫酸溶液降低至5%,时间缩短到20min,且能提高鲤鱼抗菌精蛋白的得率。 本文以引起食品腐败的主要微生物为对象,首次对鲤鱼抗菌精蛋白的抑菌谱及最低抑菌浓度(MIC)进行了研究;同时研究了pH值、温度、金属离子、蛋白酶对鲤鱼抗菌精蛋白抗菌活性的影响,结果表明:鲤鱼抗菌精蛋白在中性至弱碱性(pH7-9)条件下抗菌效果较好。鲤鱼抗菌精蛋白对温度的耐受性较好。金属离子对鲤鱼抗菌精蛋白的抗菌性影响较大,随着金属离子浓度的增大,其抗菌活性下降;Al~(3+)、Fe~(3+)等三价金属离子的影响大于Ca~(2+)、Mg~(2+)等二价金属离子,而Ca~(2+)、Mg~(2+)等二价金属离子的影响又大于K~+、Na~+等一价金属离子。α-凝乳蛋白酶可引起鲤鱼抗菌精蛋白一半以上的抗菌活性丧失;胰蛋白酶、木瓜蛋白酶可引起鲤鱼抗菌精蛋白大部分的抗菌活性丧失;而胃蛋白酶则可使鲤鱼抗菌精蛋白的抗菌活性完全丧失。研究还表明,鲤鱼抗菌精蛋白与甘氨酸、醋酸钠配合或与EDTA相复配,能大大提高其抑菌能力。 通狡采用等电点沉降分离、SePhadexG一50葡聚糖凝胶过滤层析、CM sePhar。se cL一6B离子交换层析等方法,分离提纯得到一种抗菌活性高的碱性蛋 白质,该蛋白经R P.E[P LC反相高效液相色谱检测为单一蛋白活性峰,再经 SDS一PAGE凝胶电泳鉴定为单一条带,测定其分子量为1 5320 Da。氨基酸组成分 析结果表明,‘该纯化蛋白质总碱性氨基酸含量较高,赖氨酸、组氨酸、精氨酸三 种碱性氨基酸总量为40.67%,为三鱼精蛋白(t riprotamine),其赖氨酸含量高达 22.85%。队GE凝胶等电聚焦电泳测定其蛋白质的Pl值大于10。 通过鲤鱼抗菌精蛋白对枯草芽抱杆菌生长的影响研究,发现鲤鱼抗菌精蛋白 对枯草芽抱杆菌具有较强的抑制作用,但电镜和生物摄影显微镜观察表明鲤鱼抗 菌精蛋白对枯草芽抱杆菌细胞壁没有产生破坏作用。本文还首次通过鲤鱼抗菌精 蛋白对黑曲霉胞内的唬拍酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的活性影响 研究,试验结果表明鲤鱼抗菌精蛋白对二者的活性具有明显的抑制作用。其作用 机理可能是抗菌精蛋白中的组分与该两种酶侧链的氨基酸结合,使酶的分子结构 发生变化,从而改变其构象,使酶的活性降低,导致能量物质ATP和还原力NADH 亏缺,所有的合成代谢受阻,活性的动态膜结构不能维持,代谢方向趋于水解,最后 产生细胞自溶。


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