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F_1-ATPase的分离纯化及其结构的原子力显微镜研究

朱华泽  
【摘要】: ATP合酶(F_1F_0-ATPase)是生物体中能量转换的关键酶。它定位于线粒体内膜(MF_1F_0-ATPase)、叶绿体类囊体膜(CF_1F_0-ATPase)和细菌的质膜(BF_1F_0-ATPase)上。F_1F_0-ATPase既能够利用跨膜质子动力势合成ATP,也能够水解ATP形成生物体生命活动所需的质子梯度。各种不同来源的F_1F_0-ATPase有着相似的结构:即都含有跨膜的F_0和突出在膜外的F_1两大部分。在具体的亚基组成上,F_0部分的亚基有a、b和c(叶绿体中对应于亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),各亚基的准量关系为ab_2c_(9-12)(ⅠⅡⅢ_(14)Ⅳ):F_1部分的亚基有α、β、γ、δ和ε,各亚基的准量关系为α_3β_3γδε.另外γεC_(9-12)(γεⅢ_(12-14))亚基构成了合酶的“转子”,而ab_2α_3β_3δ(α_3β_3δⅠⅡⅣ)构成了合酶的“定子”。在ATP合酶的工作过程中,F_0部分起到转运质子,建立合成ATP时所需要的跨膜质子梯度势,由于合酶的催化位点位于α和β亚基上,所以F_1部分是催化合成ATP的部位。本论文工作主要是对线粒体和叶绿体F_1-ATPase进行了分离纯化,并用原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)对ATP合酶F_1的结构进行了研究。 (1)CF_1-ATPase的分离纯化:在分离菠菜叶绿体CF_1-ATPase时,首先用焦磷酸钠溶液从内囊体膜上洗脱CF_1,然后分别通过纤维素DE-52柱层析和硫酸铵分级分离对其纯化;在分离猪肝线粒体MF_1时,首先通过超声处理的方法使MF_1从线粒体内膜上解离下来,然后分别通过硫酸铵分级分离和热处理的方法对其纯化。实验发现利用这两种方法分别从叶绿体和线粒体中分离得到了纯度较好的MF_1-ATPase; (2)凝胶电泳实验:对所分离得到的两种F_l-ATPase都分别做了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和凝胶内酶活性分析。实验发现所分离得到的样品纯度好,均含有F_1部分的主要亚基成分,凝胶内酶活性实验表明被分离的F_1部分仍具有较强的水解ATP的能力。 (3)酶活性实验:主要进行了温度、pH值、KCl浓度对F_1-ATPase水解ATP活性的影响。实验发现,冰浴处理会使酶分子分解,使其丧失活性,但20%的甲醇溶液能有效的保护酶分子的完整性,推测这与醇类的羟基能在酶外形成一个疏水区,从而起到保护作用有关;两种不同来源的F_1-ATPase在pH值为7.4至8.0区间时都很稳定,但叶绿体来源的CF_1在pH值为8.0时保持了更高的水解活性,这与线粒体来源的MF_1略有不同,后者在pH值为7.4时有相对较高的水解活性;在高浓度的KCl存在的情况下,F_1被解离成具有活性的亚基,对其进行透析脱盐重组后发现酶分子能够再次恢复水解活性,这为获取具有活性的亚基单元提供了良好的方法。 (4)AFM观测实验:利用接触模式下的原子力显微镜观测了F_1-ATPase分子,得到了高清晰度的AFM形貌图像。在得到的图像中两种酶分子均呈现出球形结构,利用AFM的颗粒度分析软件测得酶分子平均直径为18nm,按其直径大小可以分为三类,推测其分别对应着ATP合酶的三种状态,即空置态、疏松结合态和紧密结合态。对叶绿体来源的酶分子进行多次扫描发现,探针会对酶分子造成不可逆的损伤。使酶分子呈现出彗星样形状。 通过本研究,不仅探索出了一套适合本实验室的F_1-ATPase的提取纯化方法,而且将AFM用于该酶分子的形貌研究当中,为进一步利用AFM研究生理状态下的F_1F_0-ATPase分子的结构提供了基础。


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