湖北钉螺（Oncomelania hupensis）微卫星DNA文库的建立及多态性位点的筛选

【摘要】： 1.目的 湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间寄主,在传播日本血吸虫病中有着至关重要的作用。在我国主要分布于长江流域及其以南的江苏、浙江、安徽、江西、福建、上海、湖南、湖北、广东、广西、云南、四川12个省、直辖市、自治区。 由于分布广泛及地理隔离的影响,湖北钉螺在我国各地区种群之间产生了明显的遗传变异,进而分化为多个不同的亚种;且在相同条件下,不同地区钉螺对日本血吸虫易感性不同,各地钉螺具有显著性差异。因此,对湖北钉螺的遗传多样性分析既有其生物学上的理论价值,又有着医学上的实用价值。本研究选用了微卫星DNA技术构建了湖北钉螺微卫星DNA文库,并在此基础之上,选取多态性较好的微卫星DNA序列对6省区的30多个采集点共200多个个体进行了群体遗传学分析。 2.方法 选用中国大陆湖北省潜江浩口野生钉螺品系,建立湖北钉螺微卫星DNA文库:使用酚-氯仿法提取高质量的湖北钉螺基因组,并在经过Sau3AI酶进行酶切之后,回收200bp至900bp之间的片段,在连接SAUL接头之后进行PCR富集,利用被生物素标记的10条寡核苷酸探针与亲和素结合进行微卫星DNA序列的筛选、超滤离心富集,重复两次后可得到大部分微卫星DNA序列。 在所建立的微卫星DNA文库中,选取重复特征较为明显、长度适宜的微卫星DNA序列,来进行引物的设计与合成,经PCR技术富集,5%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染,同时利用基因扫描技术进行多态性位点的筛选。 选取6个多态性较好的微卫星位点对湖南、湖北、江西、安徽、江苏和浙江6省区的200多个个体进行群体遗传学分析。 3.结果 (1)测序共获得292条序列,其中含有微卫星DNA的序列共有266条。在此266条微卫星DNA序列中发现有12条序列是完全相同的,所有序列长度均在200 bp以上。对照微卫星序列的计算准则,获得有效的微卫星DNA序列共254条,其中完整重复序列66条,占25.98%,非完整重复序列94条,占37.01%,复合重复序列有94条,占37.01%。 (2)在湖北钉螺微卫星DNA文库中,挑选了67个典型微卫星位点,在两端侧翼区域设计引物,共设计了67对微卫星DNA引物,最后选择性合成20对扩增引物,其中4个位点出现非特异性扩增。其余16对微卫星引物经初步筛选得到了14个(70%)湖北钉螺多态性的微卫星位点,其中已完成了7个位点各30个样本的引物荧光标记与基因扫描,其中有6个位点的效果较好,6个位点中仅P84位点的观测杂合度和PIC值较低,分别为0.1667和0.1813,其余位点的观测杂合度和PIC值范围在0.36-0.8929和0.8437-0.9289间,具有较好的多态性。 (3)共对湖南、湖北、安徽、江西、江苏、浙江、四川的7个群体219个样本的6个微卫星位点进行了基因扫描。结果以Excel表格形式输出,共获得2628个微卫星DNA位点数据。座位平均等位基因数目为34.17个,平均总群体遗传杂合度、群体内平均杂合度分别为0.869和0.023。Hardy-Weinberg平衡检验表明,6个微卫星DNA位点中,T5-13、T6-27、P82处于平衡状态,T5-11和T4-22分别在湖北、江苏群体中处于不平衡状态,而P84在安徽、江西、江苏和浙江群体中均处于不平衡状态。 4.结论 (1)在所建立的微卫星DNA文库中,双核苷酸重复序列占绝大多数(73.62%),三核苷酸重复序列次之,多核苷酸重复序列最为少见;双核苷酸重复中以(CA)_n和(GT)_n最为常见,重复次数最多的可达98次。 (2)利用筛选得到的6个位点30个样本进行荧光标记及基因扫描,不同位点的等位基因数不同,最少的5个,最多22个,平均16.7个;其中P84位点的PIC＜0.25,在6个微卫星DNA位点中多态性最低,显示为低度多态座位,其余位点的PIC均＞0.5,获得了较好的多态性。 (3) 6个微卫星DNA位点中,P84、T5-11和T4-22三个位点分别不同程度地处于不平衡状态。在总群体中,共检测到205个等位基因,不同位点在种群间平均为15.33个;等位基因在不同群体中的分布无明显的集中趋势。 群体内遗传分析显示,所有位点平均的观测杂合度、期望杂合度和PIC值分别为0.637、0.811和0.777,多态性明显,综合所有指标的信息,湖北钉螺湖北群体遗传变异程度最高,江苏群体最低。 群体间遗传变异分析表明,江苏和江西群体间具有较高的遗传分化程度,安徽与湖南群体间则分化程度较小。总群和群体内基因交流不高,因而杂合度较高;然而群体间分化系数表明群体间分化较低,遗传变异主要来自种群内的个体间。