高糖胁迫下产甘油假丝酵母细胞质膜抗逆应答机制的初步研究

【摘要】：产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有抗逆性强、糖代谢迅速、目标产物转化率高等特点,特别是在500 g·L~(-1)的高葡萄糖浓度下仍可维持很好的发酵性能,是一株可应用于节能环保浓醪发酵的渗透压工业酵母。酵母细胞质膜是其与外界环境进行物质能量交换和信号传递的重要场所,在胁迫压力下会发生一系列的动态应答,与此相关的理论机制可为指导实际生产提供重要的科学依据。本研究在建立了一种适合C.glycerinogenes质膜提取方法的基础上,对其高糖胁迫下质膜的组成和相关基因的全局转录应答机制展开研究,主要结果如下:(1)采用先制备原生质体、再低渗裂解获得粗膜提取物、最后双水相分离纯化细胞质膜的策略,优化了原生质体的制备方法和粗膜的两相分离纯化体系,得到一种适合于C.glycerinogenes的高效质膜提取方法,优化后质膜纯度平均可达65%以上。(2)研究发现,C.glycerinogenes在高浓度葡萄糖胁迫下,细胞质膜中的不饱和脂肪酸(特别是油酸)和麦角固醇的相对含量显著增加,而细胞质膜的流动性和通透性出现不同程度的降低。因此,C.glycerinogenes细胞质膜在高糖胁迫下通过增加油酸的含量来稳固细胞质膜的流动性,通过增加麦角固醇的含量来维持质膜稳态。(3)利用RNA-Seq测序技术考察高糖胁迫下C.glycerinogenes细胞质膜相关基因的全局转录应答情况,结果发现:获得了85个质膜相关差异显著表达基因,其中68个上调,17个下调;麦角固醇合成相关基因ERG6、ERG2、ERG3、ERG5、ERG4显著上调,这与麦角固醇含量增加的结果相符合;不饱和脂肪酸合成途径中大部分基因显著上调;1个葡萄糖转运蛋白基因的差异表达倍数最高(log2=9.55);糖脂合成、MAPK途径、mTOR途径的差异基因均显著上调。此外,受HOG途径调控的甘油合成关键基因GPD1没有上调,而模式菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在高糖胁迫下更多依赖于胞内甘油的合成。综上说明C.glycerinogenes在高糖胁迫下更多依赖于细胞质膜和细胞生长相关基因的调控应答。(4)在RNA-Seq测序结果的基础上,利用RT-qPCR、基因过表达、异源表达和重组菌株的高糖耐受性测试等方法挖掘了6个高糖抗逆性能较好的C.glycerinogenes细胞质膜相关基因。它们分别是葡萄糖转运蛋白Cg2615(A0A1V2LT11)和Cg5001(A0A2U9R987)、推定的细胞色素P450基因Cg4756(A9YUC7)、被编码具有C-5甾醇去饱和酶活性的Cg3824(A0A099P0V3)、编码具有甘露糖基转移酶活性的Cg2914(A0A099P2M9)和推定的尿素跨膜转运蛋白Cg2071(A0A1Z8JUV2)。这6个基因均可提高S.cerevisiae的高糖耐受性,为工程菌株的改造提供了基因来源。