自噬在人骨髓间充质干细胞放射损伤过程中的作用研究

【摘要】：目的：探讨放射应激时人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的自噬反应特点,并研究自噬在hBMMSCs放射损伤过程中的作用。 方法：本实验利用X线单剂量照射建立体外hBMMSCs放射损伤模型。 1.(1)应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测不同照射剂量组及照后不同培养时间hBMMSCs自噬相关基因Beclinl和微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAPLC3,简称为LC3)的mRNA表达；(2)应用Annexin-V/PI双标法检测0、2、4、8Gy X线照射后4h hBMMSCs凋亡率和坏死率的变化。 2.(1)应用自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)和自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)调节放射应激时hBMMSCs的自噬反应,随机分为正常对照组、照射组、HCQ处理组、RAP处理组、HCQ联合照射组、RAP联合照射组；(2)通过透射电子显微镜观察各实验组hBMMSCs自噬形态学变化；(3)应用RT-PCR技术检测各实验组hBMMSCs自噬相关基因Beclinl和LC3的mRNA表达；(4)应用Annexin-V/PI双标法检测各实验组hBMMSCs凋亡率的变化。 结果：(1)正常体外培养hBMMSCs中低表达Beclinl和LC3,分别给予2Gy、4Gy、8GyX线照射后2h,上述两种基因的表达水平均呈照射剂量依赖性升高；此外,经8GyX线照射,两基因表达水平均于照后2h显著升高,4h达高峰,8h逐渐恢复,12h接近正常。(2)分别给予2Gy、4Gy、8GyX线照射后4h, hBMMSCs的凋亡率随照射剂量的增加而降低,坏死率和死亡率随照射剂量的增加而升高,但升高幅度较小,并且总体凋亡率比坏死率变化明显。(3)HCQ处理组的自噬泡阳性细胞比例与正常对照组相比无明显变化(P0.05),为各组中最低；RAP联合照射组的自噬泡阳性细胞比例为各组中最高,RAP处理组次之；HCQ联合照射组与单纯照射组相比自噬泡阳性细胞比例无明显差异(P0.05),与正常对照组相比明显增加(P0.05),但明显低于RAP处理组和RAP联合照射组(P0.05)。(4) HCQ处理组Beclinl和LC3mRNA的表达水平与正常对照组相比无明显变化(P0.05),为各组中最低；RAP联合照射组两基因的表达水平为各组中最高,RAP处理组次之；HCQ联合照射组与单纯照射组相比,其Beclinl的表达无明显变化(P0.05),LC3的表达稍低(P0.05),两者与正常对照组相比两基因的表达均明显升高(P0.05),但低于RAP处理组和RAP联合照射组(P0.05)。(5) HCQ和RAP处理组的凋亡率与正常对照组相比无明显变化(P0.05),为各组中最低；照射组的凋亡率与正常对照组相比明显升高(P0.05)；HCQ联合照射组与单纯照射组相比凋亡率急剧升高(P0.05),达各实验组中最高值,RAP联合照射组与单纯照射组相比凋亡率明显降低(P0.05),但仍高于正常对照组(P0.05),其降低幅度远远没有HCQ联合照射组升高幅度大。 结论：(1)正常生理状态下,体外培养hBMMSCs的自噬水平很低；(2)放射应激能够诱导体外培养hBMMSCs的自噬反应；(3)放射后短时间内(4h)体外培养hBMMSCs的损伤机制可能以凋亡为主；(4)正常生理状态下,HCQ不影响体外培养hBMMSCs的自噬水平和凋亡率,而RAP能明显提高其自噬水平,但不影响其凋亡率的变化；(5)在体外培养hBMMSCs放射损伤过程中,HCQ能够抑制放射诱导的自噬反应,促进hBMMSCs凋亡,而RAP则能提高放射诱导的自噬水平,降低其凋亡；(6)自噬对体外培养hBMMSCs具有一定的放射保护作用,可能与其放射耐受性有关。