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胡杨油菜素内酯合成酶基因CPD (PeCPD)的克隆及功能分析

武海军  
【摘要】:油菜素类固醇(brassinosteroids, BRs)是一类新发现的植物生长调节物质,被称为第六大类植物激素,在植物整个生长和发育中起重要的作用,其中包括细胞伸长与分裂、维管束分化、光形态建成、叶和根的发育、衰老、育性以及对逆境胁迫的响应等。BR生物合成途径及其遗传调节是当今植物生物学研究的热点问题。目前已经取得了重要进展,但主要集中在拟南芥、水稻、番茄和豌豆等这些一年生草本植物,而在多年生木本植物,尤其是林木中鲜有研究。CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)是一个与BR合成相关的基因,最早鉴定于拟南芥,编码一种细胞色素单加氧化酶CYP90A1,在BR生物合成过程中催化22-OH-CR向22-OH-4-en-3-one转变。为探讨木本植物CPD基因的功能,本研究以极端耐旱、耐高温和耐盐碱的珍稀树种胡杨(Populus euphratica)和耐逆性相对较差的箭杆杨(P. nigra var. thevesitina)为对象,从中克隆到了与拟南芥CPD同源的cDNA全序列,构建了相应的植物表达载体,并将这些载体分别导入拟南芥cpd突变体(Atcpd)和野生型(Atwt),获得了多种转基因系。在此基础上,对这些转基因系的形态学、解剖学、遗传学、细胞学、生理学和分子生物学特征进行了详细的分析与比较。主要结果如下: 一、采用电子克隆和3'RACE策略,从胡杨和箭杆杨中克隆出了与拟南芥CPD同源的cDNA全序列(命名为PeCPD和PnCPD);对PeCPD和PnPCD的生物信息学分析显示: 1) PeCPD和PnCPD cDNA分别长1746bp和1553bp,二者总长不同,但ORF大小完全相同,都编码一个由476个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列一致性为97%。 2) PeCPD和PnCPD编码的蛋白与CYP90A蛋白家族具有67-92%的同源性,因此确定该蛋白属于CYP90A家族(分别命名为PeCYP90A和PnCYP90A)。 3) PeCYP90A与PnCYP90A间的同源性显著高于PeCYP90A/PnCYP90A与毛果杨CYP90A之间的同源性。 4) PeCYP90A/PnCYP90A与木本植物甜橙、番木瓜和山茶CYP90A的进化关系相反地小于PeCYP90A/PnCYP90A与草本植物豌豆和豇豆CYP90A的进化关系。 5)不同CYP90A之间,根据信号肽序列预测的亚细胞定位也有所不同。 二、采用Real-Time qRT-PCR法分析了不同派(section)杨树及胡杨不同组织(器官)之间PeCPD基因表达水平,结果显示: 1)在青杨(P. cathayana,青杨派)、胡杨(P. euphratice,胡杨派)、箭杆杨(P. nigra var. thevesitina,黑杨派)、大叶杨(P. tomentosa,大叶杨派)和新疆杨(P. euphratice,白杨派)中的相对表达量分别为1.0,1.4,1.1,0.8和1.1,胡杨中的表达量最高,大叶杨中的表达量最低。 2)在胡杨中,成熟叶中的表达量最高,中间叶次之,幼叶最低。PeCPD在根中完全不表达,在叶脉和枝形成层中低表达。 三、将PeCPD cDNA插入植物表达载体pMDC43,构建了由花椰菜花叶病毒启动子(CaM35S)驱动的PeCPD表达载体35S::PeCPD,由CaM35S驱动的PeCPD-GFP融合表达载体35S::PeCPD-GFP,以及由拟南芥CPD基因启动子(AP)驱动的PeCPD表达载体AP::PeCPD. 四、将35S::PeCPD-GFP、35S::PeCPD和AP::PeCPD分别导入拟南芥cpd突变体(Atcpd),分别得到3(C35CG1/2/3)、2(C35C1/2)和3个(CAPC1/2/3)Atcpd-PeCPD转基因系。对以上各转基因系的形态学、遗传学、生理学和解剖学研究显示: 1)T1代C35CG1/2/3、C35C1/2和CAPC1/2/3系与Atcpd(?)目比,莲座叶完全展开,植株个体增大,开花期提前,花茎高度和数目增加。与Atwt相比,C35CG和C35C系莲座叶长宽比减小,叶柄缩短,开花期延迟,株高降低;CAPC系叶长宽比减小,叶面积和茎直径增加。C35CG系雄性不育,人工自花授粉也不育。C35C1系早期花不育,后期花人工自花授粉可育。CAPC1/2早期花不育,后期花正常可育,而CAPC3系完全可育。T3代C35C1和CAPC1/2/3表型与T1代基本相同,表型相对恢复程度的大小依次为AtcpdC35C1CAPC1/2CAPC3/Atwt。 2)C35C1和CAPC1系早期花不育与花丝细胞伸长受阻,导致花丝缩短,花药无法与柱头接触有关。 3)与Atcpd相比,C35C1、CAPC1和CAPC3系叶表皮细胞大小,细胞凸起(lobe)的数目与lobe长度增加,气孔密度降低。与Atwt相比,C35C1系叶表皮细胞大小,lobe数目与lobe长度减少(小),气孔密度增加;CAPC1和CAPC3系叶表皮细胞大小,lobe数目与lobe长度及气孔密度没有显著变化。 4)CAPC1和CAPC3系莲座叶海绵组织细胞数目减少,叶维管束木质部细胞较Atcpd和Atwt明显增加,茎维管束数目,维管束木质部、原形成层细胞数目也显著多于Atcpd和Atwt。 5)在黑暗和光照条件下C35C1、CAPC1和CAPC3系下胚轴伸长速率显著大于Atcpd,黑暗中子叶形状与野生型的相似,子叶不展开,呈钩状。 五、将35S::PeCPD-GFP.35S::PeCPD和AP::PeCPD分别导入拟南芥野生型(Atwt),分别各获得10个(035CG),7个(035C)和7个(OAPC)Atwt-PeCPD转基因系。对其中各1个转基因系(035CG24、OAPC4和035C7)的形态学、生理学和解剖学观察显示: 1)种子萌发期,035CG24、OAPC4和035C7系下胚轴和根伸长速率与Atwt相比显著增加,对盐的耐受力增强:营养生长期,035CG24系个体增大、叶面积增加、气孔密度减少;成熟期株高、果荚数、果荚长度和茎的直径也显著增加。OAPC4和035C7系无显著性变化。 2)将各Atwt-PeCPD转基因系((?))与生长素应答因子拟南芥转基因系(DR5-GUS)((?))杂交,发现F1代植株根中GUS活性与根伸长的速率成正相关,即根伸长的速率越快,根中GUS活性越强。 3)组织学观察发现,与Atwt相比,035CG24系叶片增厚,叶肉细胞变大,海绵组织细胞间的气腔增多,海绵细胞数目减少。茎维管束数目,维管束木质部和原形成层细胞数目增加。木质部细胞总数和原形成层细胞总数与茎的直径大小成正相关。 六、Real-Time qRT-PCR分析以上各转基因系以及Atcpd和Atwt之间PeCPD和其它BR相关基因的转录水平,结果显示: 1)C35C1、CAPC1和CAPC3系表型恢复程度大小与PeCPD和受BR正调节的BAS1的表达量成正相关,与BR负调节的DWF4和BR60X2的表达量成负相关;PeCPD的表达量与BAS1的表达量成正相关,与DWF4和BR60X2的表达量成负相关;外源BR正调节的TCH4和SAUR-AC1表达量与植株的恢复程度无明显关系。 2)035CG24,035C7和OAPC4系表型超Atwt程度与PeCPD和BAS1表达量成正相关,PeCPD表达量与BAS1表达量成正相关;DWF4表达量稍高于野生型,BR60X2表达量低于野生型;TCH4和SAUR-AC1表达量与植株表型也无显著关系。 七、采用ELISA方法分析了各Atcpd-PeCPD和Atwt-PeCPD转基因系内源BR的含量,结果显示,各转基因系及Atcpd和Atwt内源BR水平大小依次为O35CG24CAPC2O35C7AtwtC35C1CAPC3CAPC1AtcpdOAPC4。总BR含量基本上与PeCPD表达量成负相关,即异源PeCPD表达水平越高,内源BR含量越低,暗示BR合成通路恢复。 八、采用双向电泳检测了CAPC3系和Atcpd之间蛋白表达谱的差异。ImageMaster2D Platinum Version5.0软件分析显示,CAPC3和Atcpd分别显示568和411个蛋白点,前者比后者多出157个蛋白点。其中可匹配的有236个(占41.5%),不匹配的有329个(57.9%)。在CAPC3中,有8个匹配点表达量显著上调,有3个匹配点表达量显著下调,另有19个非匹配点表达量甚高。对这19个非匹配点中最显著的7个点进行质谱鉴定发现,其中5个与光合作用有关,一个与植物抗逆性有关,另一个与叶绿体RNA的加工修饰有关。有文献报道,这几种蛋白均受BR正调节。 九、用35S::PeCPD-GFP转化烟草表皮细胞发现,PeCPD-GFP信号主要分布在质膜和细胞质内的一些网状结构上。这种分布模式与已报道的内质网标记蛋白的分布模式相同,这表明PeCPD蛋白可能主要定位于内质网。根据以上结果,主要得出以下结论: 1)胡杨CPD (PeCPD)基因与拟南芥CPD (AtCPD)基因的功能基本相似,都可能通过控制BL合成,调节植物的生长发育,因为异源PeCPD的表达明显地使Atcpd的表型得以恢复,并且导致其它BR合成相关基因的表达水平以及内源BR水平发生相应的变化。 2) PeCPD可能还存在其它功能,因为PeCPD异源表达并不能使Atcpd的表型完全恢复。恢复后的植株在形态学、解剖学、育性、组织和细胞学方面与野生型相比仍存在明显的差异,即使在恢复程度最好转基因系中。 3) PeCPD可能参与了叶和茎的发育,这一调节过程可能独立于BR信号通路,因为在BL水平并没有完全恢复的CAPC1系中,虽然株型大小与野生型一致,但叶变宽,茎分枝增多,茎增粗。 4) PeCPD功能也可能与光合作用有关,因为Real-Time qRT-PCR分析表明,PeCPD在成熟胡杨叶中的表达量显著高于在中、幼年叶中的表达量。此外,蛋白组学分析显示,在CAPC3系中,在所鉴定的7个特异蛋白点中有5个与光合作用有关。 5) PeCPD表达水平在杨树中具有种和组织器官的特异性。 6)在Atwt-PeCPD转基因系中,CaM35S启动子的效率显著地高于拟南芥CPD自身启动子的效率,而在Atcpd-PeCPD转基因系中,CaM35S启动子的效率出乎意外地显著低于拟南芥CPD自身启动子的效率,原因可能与CaM35S启动子在Atcpd中受抑制有关。 7) PeCPD异源表达可促进Atwt根的生长(伸长),这种促进作用可能是通过促进的生长素合成或分布实现的。 8) PeCPD是一个优良的可用来转化其它林木或农作物的基因,因为在本研究中发现一些Atwt-PeCPD转基因系植株个体变大、株高增加、种子产量、茎的直径增加和抗逆性增强。


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