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醉马草—内生真菌共生体对胁迫的响应及其次生代谢产物活性的研究

张兴旭  
【摘要】:醉马草(Achnatherum inebrians (Hance) Keng)为禾本科(Gramineae)芨芨草属(Achnatherum)的多年生草本植物,是我国北方天然草原主要的烈性毒草之一,与甘肃内生真菌(Neotyphodium gansuense Li et Nan)形成共生是其对家畜致毒的原因。本研究以带内生真菌(E+)和不带内生真菌(E-)的醉马草群体为材料,研究了其抗虫性的异同;探讨了干旱和盐胁迫对E+醉马草产生麦角类生物碱的影响及其对重金属镉胁迫的响应;分离、鉴定了E+醉马草中的生物碱和挥发油等次生代谢产物,测定了其生物活性。主要结果如下: 1.室内饲喂和田间取食试验的结果表明,内生真菌的侵染显著(P0.05)降低了亚洲小车蝗(Oedaleus decorus)和针毛收获蚁Messor aciculatus)对醉马草叶片和种子的取食量。 2.室内萌发和盆栽试验结果表明,当镉浓度≥100μmol/L时,内生真菌侵染显著(P0.05)增加了醉马草种子的萌发和幼苗的生长,E+幼苗抗氧化酶活性和脯氨酸含量均显著(P0.05)高于E-幼苗,但是E-幼苗丙二醛(MDA)的含量显著(P0.05)高于E+幼苗。内生真菌侵染可以缓解镉胁迫对醉马草的毒害作用。 3.温室盆栽试验结果表明,干旱胁迫和盐胁迫均增加了E+醉马草中麦角生物碱的积累,两种胁迫条件下,均是麦角新碱的含量显著高于麦角酰胺(P0.05)。 4.与乙醇冷浸法相比,超声波结合乙醇热回流法可从E+醉马草中提取更大量的粗浸膏;分离获得了E+醉马草中麦角类生物碱的纯品化合物,通过结构解析确定其为异麦角新碱和麦角新碱。E-醉马草不含有这两种麦角生物碱。 5.自E+醉马草获得的含有生物碱的粗浸膏对细交链孢(Alternaria alternata)、根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、新月弯孢(Curvularia lunata)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)和腐皮镰孢(Fusarium solani)等5种植物病原真菌以及绿色木霉菌(Trichoderma viride)的菌落生长、孢子萌发和芽管伸长均具有较强的抑制作用。两种麦角生物碱对动物平滑肌细胞均具有明显的细胞毒活性,且生物碱浓度与细胞的抑制率呈显著正相关(P0.05),回归方程分别为:Y麦角=0.0041x+0.205(R2=0.945,P0.05)和Y异麦角=0.0032x+0.2672(R2=0.9411,P0.05),麦角新碱和异麦角新碱的半致死浓度分别为71.95μg/mL和72.75μg/mL。 6.通过水蒸汽蒸馏法,得到了E+和E-醉马草植株以及分离自E+醉马草植株中内生真菌的挥发油,通过气相色谱和质谱仪联用(GC-MS)分析其结构,发现自E+、E-植株和内生真菌中提取的挥发油分别含有61、59和34种化合物。其中7种化合物同时存在于E+、E-醉马草和内生真菌的挥发油,31种化合物同时存在于E+和E-醉马草的挥发油中,5种化合物为E+醉马草及其内生真菌所特有。十七烷烃是E+和E-醉马草挥发油中含量最高的化合物,正十四烷烃是E+醉马草及其内生真菌挥发油中的主要成分,二氧杂环戊烷为内生真菌主要的挥发油成分。 7.自E+与E-醉马草植株提取的挥发油对细交链孢、根腐离蠕孢、新月弯孢、燕麦镰孢、腐皮镰孢和绿色木霉等真菌均有抑制作用,与E-植株相比,E+植株中提取的挥发油有更强的抑菌活性(P0.05),其中对腐皮镰孢孢子萌发抑制率最强,其半致死浓度(IC50)值为0.224mg/mL。E+与E-醉马草植株中提取的挥发油对多年生黑麦草(Lolium perenne)、高羊茅(Festuca arundinacea)和草地早熟禾(Poa pratensis)等3种牧草的种子萌发和幼苗生长亦有抑制作用,且受到的抑制随挥发油浓度而增加。自E+植株中提取的挥发油的抑制作用强于E-植株中的,当挥发油浓度达到300mg/mL,三种牧草的发芽率、胚芽长、胚根长、鲜重和干重等均表现出显著差异(P0.05),过氧化物酶(POD)、抗坏血酸酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及可溶性糖和脯氨酸含量等表现出同样差异;超氧化物歧化酶(SOD)活性和电导率值以及MDA含量则是E+挥发油处理显著(P0.05)高于E-处理。


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