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组织因子与胃癌生物学行为关系的实验研究

俞永江  
【摘要】:目的 组织因子(tissue factor, TF)是机体外源性凝血途径的始动因子,近来研究发现其在信号转导、炎症、动脉粥样硬化、胚胎发育、肿瘤血管生成、肿瘤生长、转移等方面都有一定的作用。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前证实包括胃癌在内的多种肿瘤细胞TF表达异常,并且其表达水平与肿瘤的多种生物学行为有关。本实验的目的是研究TF对胃癌SGC7901细胞的作用,探讨TF对胃癌细胞增殖、侵袭、转移、凋亡、耐药性等多种生物学行为的影响,评价应用RNA干扰技术沉默TF基因对胃癌SGC7901细胞体外及体内的抗肿瘤效应,为胃癌的治疗提供新的实验依据。 方法 首先采用PCR自人胎盘组织克隆目的基因TF,应用脂质体介导法将基因导入SGC7901人胃癌细胞株,采用G418法筛选稳定表达TF的细胞,采用RT-PCR及Western blot检测TF mRNA及蛋白的表达,通过Transwell实验及细胞划痕实验观察细胞体外侵袭转移能力的变化。然后自基因库查序获得TF基因mRNA序列,设计与合成特异性针对TF基因的siRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-TF表达载体,与pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体连接,连接产物转化至大肠杆菌DH5α中,用质粒提取试剂盒提取阳性克隆,采用酶切法和测序法鉴定目的基因,同时利用自动分光光度计测定所得质粒的浓度和纯度。采用脂质体转染法将重组质粒和空质粒转染至细胞中,用G418筛选建立稳定细胞系。采用RT-PCR检测不同实验组细胞中TFmRNA的表达情况,流式细胞仪检测各组细胞表面TF抗原,CCK8法测定细胞增殖能力;各组细胞与奥沙利铂共同孵育,在酶联免疫检测仪上测定吸光度值并计算奥沙利铂对各组细胞的生长抑制率;细胞体外侵袭转移能力采用划痕实验及侵袭实验测定,流式细胞术检测细胞的凋亡,通过裸鼠人胃癌移植瘤小鼠模型评价TFsiRNA在体内对肿瘤生长的抑制作用。 结果 成功构建了稳定、高效表达组织因子的人胃癌细胞系SGC7901/TF,细胞表面TF mRNA及TF抗原表达显著增高,与阴性对照及空白对照组相比,Transwell实验及划痕实验显示转染组细胞的体外侵袭转移能力显著增强。设计与合成针对组织因子的4个siRNA序列及一个阴性对照序列,酶切鉴定结果显示质粒均为阳性的重组载体,测序结果表明合成质粒的序列完全正确并且成功克隆到所选载体上,紫外分光光度计检测显示提取质粒的浓度和纯度均符合要求,可以进行转染,用倒置荧光纤维镜观察24h、48h和72h细胞表达绿色荧光蛋白的细胞转染率分别为25%、40%和30%。RT-PCR结果显示与空白对照组和阴性对照组相比,pGPU6/GFP/Neo/TF转染各组细胞的表达量降低,TF-2基因的表达量最低,抑制效果最好,流式细胞仪检测各组细胞表面TF抗原,实验组表达量显著下降;CCK-8法检测细胞的增殖性,发现TFsiRNA沉默TF基因表达时间依赖性抑制细胞的增殖能力,加入奥沙利铂后转染组细胞的抑制率显著高于对照组,显示TFsiRNA降低化疗药物的耐药性。为证实TFsiRNA对肿瘤迁移和侵袭效应进行了划痕实验和细胞侵袭性实验,结果表明TFsiRNA可降低胃癌细胞的转移潜能。为进一步评价TF基因沉默后对胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用,转染后48h以双染色法检测凋亡,流式细胞术结果显示TFsiRNA组细胞凋亡率显著增高。人胃癌细胞裸鼠移植瘤实验结果显示实验组肿瘤体积及肿瘤重量明显少于对照组,表明TFsiRNA在裸小鼠体内抑制人胃癌SGC7901细胞的生长。 结论 组织因子能够增强人胃癌细胞的体外侵袭转移能力,采用siRNA沉默TF表达可抑制人胃癌细胞的增殖能力和侵袭、转移能力,降低对化疗药物奥沙利铂的耐药性,诱导胃癌细胞凋亡,抑制人胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长,TFsiRNA为胃癌的基因治疗提供了可选择的方法之一。


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