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智能响应性纳米载体的基因输送与肿瘤治疗的研究

陈真真  
【摘要】:肿瘤是新世纪人类的头号杀手之一,基因治疗可从根本上对肿瘤进行治疗,但是裸露的基因不能直接用于治疗,因为它会被生物体内的酶酶解,因此必须有一定的载体对基因实行保护。人类的正常组织结构致密,只允许小分子类物质通过,肿瘤组织结构完整性差,通透性变高,除了允许小分子类物质通过还允许大分子类物质通过,这就为纳米颗粒用于基因输送提供了可能。纳米颗粒在基因输送中有其独特的优势,但与其他基因输送方式类似,纳米复合物在输送基因的过程中,不可避免地面临一些障碍,如:进入细胞时细胞膜的障碍、逃离溶酶体的障碍、基因在细胞质中如何完全有效释放的障碍及到达细胞核转录过程中核膜的障碍等。为此,本论文分别设计了HA-HP、电荷可翻转的CS-Aco、Dexa和PEI-SS辅助基因载体克服上述障碍。具体工作主要分为以下四部分:(一)纳米载体输送基因时,需要克服细胞膜的障碍,因此本部分工作构建了DNA/PEIS/HA-HP纳米复合物。该体系在体液循环过程中稳定存在,在HA的作用下,特异性的靶向肿瘤细胞表面CD44高表的肿瘤细胞后,在透明质酸酶的作用下HA被酶解,露出的DNA/PEIS,在体内还原性环境下,PEIS被降解为小分子量的的PEI。此时,正电荷的PEI与带有负电荷HP通过静电相互作用相结合,从而使原来和PEI结合的DNA释放到细胞质中。以输送shBmi-1为例,发现PEIS/HA-HP能够更有效地将shBmi-1导入到细胞中,敲低Bmi-1的表达。体外实验该纳米复合物发现可以使肿瘤细胞形成干性小球的能力削弱。体内使裸鼠的肿瘤形成能力受损,并最终使小鼠有更好的愈后。(二)阳离子聚合物可以用于shRNA输送,但是由于shRNA不能有效地从溶酶体中逃逸使其转染效率较低,因此,本章工作采用层层自组装方法构建了具有三层结构的纳米载体(Au-PEI/CS-Aco/PEI/shRNA),以促进shRNA从溶酶体中逃出。该体系是在原来常用的纳米体系上加入电荷可翻转的CS-Aco。CS-Aco在正常情况下带负电,而在溶酶体酸性环境下翻转为正电荷,导致纳米载体的瓦解。瓦解产生的Au-PEI和CS能够有效的冲破溶酶体膜,将PEI/shRNA释放到细胞质中。由于分子量小(1.2 KDa)的PEI,与shRNA电荷相互作用较弱,所以在细胞质中能轻松的将shRNA释放。以输送shABCG2为例,发现设计的纳米载体能够有效敲低细胞中ABCG2的表达,降低HepG2细胞对药物的抵抗性。体外实验证明,该系统有较好的肿瘤治疗效果和较低的毒副作用。(三)基因需到细胞核才能完成转录,所有基因输送体系都必须将基因输送到细胞核。地塞米松(Dexa)有细胞核靶向性,因此将Dexa加到纳米复合物中,通过激光共聚焦显微镜、核质分离等实验,发现Au-PEI/DNA/PEI-Dexa确实能够促进纳米颗粒的细胞核靶向性,并促进shRNA进入细胞核。该体系以输送pTRAIL为例,发现Au-PEI/DNA/PEI-Dexa能够将更多pTRAIL转输到细胞核中,促进TRAIL蛋白的表达,而TRAIL蛋白对于细胞凋亡及其重要,特别是能够特异地影响到肿瘤细胞的凋亡,通过高表达TRAIL蛋白促进肿瘤细胞凋亡。小鼠实验中,Au-PEI/DNA/PEI-Dexa处理组的肿瘤更小,说明Au-PEI/DNA/PEI-Dexa复合物能通过增强TRAIL的表达最终影响肿瘤的大小。并且对比实验组和对照组,小鼠的体重差异不大,说明该体系没有对小鼠造成明显的毒副作用。(四)基因载体在体液循环过程中,或者在肿瘤组织中要能够对基因实行很好的保护,但是当基因载体把基因运送到细胞质进行转录的时候,又必须能够将基因完全的释放到细胞质中。为了使基因的保护和释放之间得到平衡,本部分工作根据细胞内外氧化还原环境和pH值的不同,设计了能够对肿瘤细胞内的还原性环境和pH变化做出双响应的基因载体PA-PEI-SS。本部分工作利用凝胶电泳实验验证载体对基因的保护作用,并且模拟了细胞内酸性和还原性的环境,验证聚合物对基因的释放效果。实验结果证明,该载体对基因能够实施很好的保护,并且在外界环境变化的时候,使基因有效的释放到细胞质中。通过细胞毒性实验也验证了该载体并没有对细胞造成明显的毒性,而且转染效率也比PEI 25KDa有了明显提高。总之,本论文是在常用的阳离子聚合物PEI的基础上,针对于基因转输过程中遇到的障碍,设计了一系列智能响应的纳米复合物,并用重要的生物分子检测纳米复合物的效果,发现此系列纳米复合物确实能够通过输送基因影响细胞或者小鼠对应的生物学功能。


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