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甘肃保安族儿童龋病微生物群落结构分析

朱玉娟  
【摘要】:目的:本研究拟在前期口腔流行病学调查基础上,以甘肃保安族儿童为研究对象,通过构建细菌16SrRNA克隆文库,进行序列比对。从不同的分类学水平,对龋病组和无龋组儿童的唾液微生物群落结构,进行差异性对比分析。探寻该地区儿童口腔中的主要致龋微生物,为进一步研究微生物的致龋机制提供数据支持,并从病因学角度入手,积极采取相应措施进行早期预防,降低龋病发病率,促进儿童口腔健康。方法:按照WHO取样标准,选取20例保安族儿童为研究对象,分为龋病(BC)组和无龋(BH)组。采集非刺激性唾液,提取细菌基因组DNA,通过PCR扩增细菌16SrRNA获得目的片段,并转化至E.coli DH5a感受态细胞,筛选阳性克隆,构建16SrRNA克隆文库,进行16SrRNA测序;剔除测序后的载体和嵌合体序列,MOTHUR软件进行OTU分类计算,并进行微生物菌群多样性分析;利用RDP数据库按不同的分类水平对序列进行分类,然后将序列提交到NCBI数据库,进行同源性比对;利用MEGA软件构建系统发育树;最后进行主成分分析、聚类分析,并结合SPSS软件进行统计学分析。结果:(1)1000条序列经筛选后获得960条合格序列(平均读长为850bp),BC组为573条,BH组为387条。经MOTHUR软件计算,共得到170个OTU,归属于5个门,12个纲,16目,23个科,28个属。(2)多样性指数分析结果显示,两文库的库容良好,BC组Shannon指数高于BH组,说明BC组多样性更为丰富,但是两文库之间的Shannon指数和Simpson指数,无统计学差异(p0.05)。(3)5个细菌门:厚壁菌门(Firmicute)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria),除了梭杆菌门在BC组的检出率低于1%外,其余4个菌门检出率均大于1%;对检出率进行卡方检验,发现只有厚壁菌门和变形菌门在两组之间的差异有统计学意义(p0.05);菌门丰度进行秩和检验,发现5个菌门在两组之间的差异均无统计学意义(p0.05)。(4)28个菌属中只有链球菌属(Streptococcus)存在于所有样本中,两组之间的优势菌属也存在差异。BC组共有11个优势菌属:链球菌(Streptococcus)、孪生菌属(Gemella)、颗粒链菌属(Granulicatella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣氏球菌属(Veillonlla)、乳杆菌属(Lactobacillus)、奈瑟菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)、伴放线菌属(Aggregatibacter)、营养缺陷菌属(Abiotrophia)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。BH组共有8个:链球菌属(Streptococcus)、孪生菌属(Gemella)、颗粒链菌属(Granulicatella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、奈瑟菌属(Neisseria)、以及假单胞菌属(Pseudomonas)。(5)经统计学软件分析,发现只有罗氏菌属(Rothia)的物种丰度和检出率在两组之间的差异有统计学意义(p0.05);PCA及聚类分析结果显示,两组之间的微生物群落存在一定的差异性,且BC组的差异较BH组大。(6)除目前已知的微生物菌属之外,还存在一些尚不能准确分类到属的物种,这些物种在龋病发生或者维持口腔健康状态中的作用需要进一步探索。结论:保安族儿童口腔唾液微生物群落结构存在一定差异性。乳杆菌属、罗氏菌属、伴放线菌属、营养缺陷菌属等优势菌属为该人群的主要致龋菌,尤其是罗氏菌属的作用更为显著。链球菌属在所有的样本中均被检测到,并且丰度最高,是口腔菌群中比例最大的菌属。在口腔微生态系这个复杂的环境中,尚有很多细菌在龋病发生中所发挥的作用需要深入研究,如罗氏菌属、伴放线菌属、营养缺陷菌属等;16SrRNA克隆文库法是一种较成熟且全面的研究方法,有利于口腔微生物群落结构多样性的研究。


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