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类风湿关节炎和冠心病易感SNP分子诊断技术建立及应用

齐晓明  
【摘要】:目的自主建立RTKN2.LDLR.APOB.APOC1、ARL15、HLA-DMA、NFKB2、 CRP、ACE、NOS3、ENPP1和IQSEC1基因15个单核苷酸多态性(SNP)位点的临床常规化分子诊断方法,并探讨15个SNP位点与兰州地区汉族人群类风湿关节炎(RA)和冠心病(CHD)易感及血清学指标的相关性。方法基于高分辨熔解技术(HRM)建立类风湿关节炎7个关联基因RTKN2. LDLR、APOB、APOC1、ARL15、HLA-DMA 和 NFKB2的8个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(rs3125734 CT.rs688 CT.rs693 CT. rs4420638 AG.rs255758 AC.rs1063478 CT、rs397514331 -/A 和rs397514332CT)和冠心病5个关联基因CRP、ACE、NOS3、ENPP1 和 IQSEC1 的7个SNP位点(rs1205 CT.rs4305 AG.rs4353 GA.rs7830 AC.rs12528076 CT. rs939899 GA 和 rs1108640 GC)的聚合酶链式反应-高分辨熔解曲线(PCR-HR M)检测方法,应用于588例RA患者与200例健康对照和260例CHD患者与238例健康对照的临床标本的检测。以测序金标准验证其检测正确性和临床适用性。通过病例对照分析,筛选兰州地区汉族人群RA和CHD的易感SNP位点,并进行其血清学指标RF和抗CCP抗体的相关性分析。结果全部标本PCR-HRM扩增后均能基因分型,经直接测序金标准验证,其基因分型正确率达100%。(1)RA病例对照分析显示:① rs3125734 CT和rs688CT位点基因型和等位基因频率在RA组与对照组间的差异有统计学意义(x2=6.144,P=0.046;x2=5.793,P=0.016;x2=8.582,P=0.014:x2=5.409,P=0.020);rs255758 AC和rs1063478 CT基因型频率在两组间的差异有统计学意义(x2=6.877,P=o.032;x2=6.893,P=0.032).②性别分层后仅rs3125734 CT位点基因型和等位基因频率在男性组间差异有统计学意义(χ2=6.527,P=0.011;x2=5.899,P=0.015);rs688 CT和rs255758 AC基因型和等位基因频率女性组间差异有统计学意义(x2=8.916,P=0.012;x2=7.180,P=0.007;x2=10.788,P=0:006; x2=4.235,P=0.039)。③按血清学分层后rs3125734 CT等位基因频率在CCP阳性RA组与健康对照组间差异有统计学意义(χ2=4.708,P=0.030),其基因型频率和等位基因频率在RF阳性RA组与对照组间差异有统计学意义(χ2=7.246,P=0.027;x2=6.370,P=0.012);rs4420638 AG位点基因型频率在RF阴性RA组与对照组间差异有统计学意义(χ2=4.105,P=0.043)。④风险回归对各位点突变基因型拟合二元logistic回归分析发现在RA组与对照组rs3125734 CT突变杂合基因型CT可增加RA的发病风险(χ2=4.011,P=0.045,OR=1.613),rs688CT突变纯合基因型TT可降低RA的发病风险(x2=6.853,P=0.009,OR=0.273), rs255758 AC突变杂合基因型AC可降低RA的发病风险(χ2=6.641,P=0.010,OR=0.640):在男性RA组和男性对照组rs1063478 CT突变杂合基因型CT可增加RA的发病风险(x2=6.029,P=0.014,OR=3.204);在女性RA组和女性对照组rs688 CT和rs255758 AC突变纯合基因型TT/AC可降低RA的发病风险(x2=5.704,P=0.017,OR=0.244;x2=9.410,P=0.002,OR=0.531);在RF阳性RA组与对照组rs3125734 CT突变杂合基因型CT可增加RA的发病风险(x2=4.110,P=0.043,OR=1.853);在RF阴性RA组与对照组rs4420638 AG突变杂合基因型AG可增加RA的发病风险(χ2=4.046,P=0.044,OR=1.799)。⑤RA病例组血脂水平分析显示:rs693 CT和rs4420638 AG位点与HDL-C水平之间存在统计学差异(x2=4.762,P=0.029,OR=3.385;x2-8.226,P=0.004,OR=5.416),通过对rs693 CT和rs4420638 AG位点的突变基因型和野生型的患者HDL-C水平进行均值方差分析,结果显示两组间均存在统计学差异(F=7.312,P=0.008:F=12.482,P=0.001).(2)CHD病例对照分析显示:①rs4353 GA位点等位基因频率在CHD组与对照组间差异有统计学意义(x2=3.998,P=0.045,OR=1.297)。②rs7830 AC位点基因型频率在两组间差异有统计学意义(x2=6.369,P=0.041,OR=0.790)。③rs12528076 CT位点等位基因频率在两组间差异有统计学意义(x2=3.918,P=0.047,OR=1.335)。④CHD病例组血脂水平分析显示:rs1205 CT位点与HDL-C和LDL-C水平有相关性(x2=7.371,P=0.007,OR=7.920;x2=5.892,P=0.015,OR=0.320),通过对rs1205CT位点的突变基因型CT/TT和野生型CC的患者HDL-C和LDL-C水平进行均值方差分析,结果显示仅与HDL-C水平存在统计学差异(F=14.067,P=0.001)。结论自主建立的PCR-HRM分子诊断方法能够对15个SNP位点正确基因分型,达到临床常规化分子诊断目标。RTKN2、LDLR、APOC1、ARL15和HLA-DMA与兰州地区汉族人群RA易感相关,其中rs693 CT和rs4420638 AG联合HDL-C血清水平可预警RA发生;ACE、NOS3和ENPP1与兰州地区汉族人群CHD易感相关,其中rs1205 CT联合HDL-C血清水平可预警CHD发生。


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