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三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的研制

王志增  
【摘要】:三聚氰胺(MEL)是三嗪类含氮杂环有机化合物的一种,被用作化工原料;由于其含氮量高而被非法添加到牛奶、奶粉以及其他食品中。过量的三聚氰胺摄入会引起严重的健康问题,从而会导致了极为严重的毒奶粉事件;因此需要开发出快速、灵敏、经济的三聚氰胺检测方法,尤其需要满足随时随地和家庭自检的需求。虽然目前有很多方法用于三聚氰胺检测,但是由于需要特殊的仪器设备,不能满足随时随地检测需求,而且价格昂贵,操作繁琐;三聚氰胺胶体金快速检测试纸条虽然具有快速、灵敏、方便和可进行现场检测的优点,但是胶体金制备相对复杂,成本较高,考虑到以上检测方法存在的问题,本论文进行了三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的研制。首先通过碳二亚胺法合成人工抗原BSA-MEL,并且该人工抗原经二级质谱证明成功合成。通过固定波长253.5 nm下测定MEL、BSA和BSA-MEL的吸收值,计算得到人工抗原的偶联比为18~21:1;通过SDS-PAGE测得人工抗原达到电泳纯级别。利用细胞融合技术以及有限稀释亚克隆方法,获得四株杂交瘤细胞:4A11、4H5、6D9和6H11;而且四株杂交瘤细胞分泌的抗三聚氰胺单克隆抗体均为IgG1型。通过葡萄球菌蛋白A亲和纯化获得纯度较高的抗体,经SDS-PAGE验证,电泳纯级别,亲和常数为3.58×109 L/mol,属于高亲和力抗体。利用阿拉伯树胶粉做稳定剂,通过抗坏血酸还原亚硒酸制备出胶体硒。透射电镜显示获得了球形、均匀、稳定、平均粒径为57.97±6.84nm胶体硒纳米颗粒。该纳米颗粒容易重悬适合做蛋白探针。通过颜色反应确定抗三聚氰胺单克隆抗体与胶体硒和胶体金的最佳结合pH是8.5,最佳包被浓度是5μg/mL;通过梯度试验获得硝酸纤维素膜上抗原BSA-MEL的最佳包被浓度为1.0mg/mL。利用胶体硒和抗三聚氰胺单克隆抗体制备出三聚氰胺侧向层析试纸条。WHO规定婴幼儿奶粉中三聚氰胺最大允许量为1.0 mg/kg、成人及其他食品中三聚氰胺最大允许量为2.5 mg/kg。该试纸条对液态奶的检测灵敏度是0.15 mg/kg的三聚氰胺,对奶粉的检测灵敏度是1.0 mg/kg,对动物食品检测的灵敏度是0.8 mg/kg;与三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺等三聚氰胺同系物没有交叉反应;在密闭、干燥环境中储存一年后仍然可以稳定检测出液态奶、奶粉和动物食品中0.15mg/kg、1.0 mg/kg和0.8 mg/kg以上的三聚氰胺;能够满足人们快速检测三聚氰胺的需求。与胶体金相比,胶体硒具有制备更为简单、制备原料成本更为经济、对电解质不敏感等优点。


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