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传代和低氧培养对山羊颞下颌关节盘细胞表型及细胞骨架的影响

何晓兰  
【摘要】:目的:探讨传代和低氧培养对山羊颞下颌关节盘细胞表型和细胞骨架的影响,为关节盘组织工程自组装技术种子细胞的选择提供依据,为关节盘细胞培养选择适宜的氧环境。方法:体外分离、培养山羊颞下颌关节盘细胞,传代至第三代(P3),收集原代(P0)至第三代细胞(P3)。P3代细胞分别于不同低氧水平(2%O_2,4%O_2,8%O_2)下培养,每次均以常氧(21%O_2)培养作为对照。通过细胞形态学、糖胺多糖和胶原蛋白染色观察,I、II型胶原蛋白免疫细胞化学和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)进行细胞表型鉴定。通过细胞骨架蛋白免疫荧光染色和RT-qPCR检测关节盘细胞骨架蛋白肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)和波形蛋白(Vimentin)表达情况;MTT实验及流式细胞术检测不同氧浓度下关节盘细胞生长、增殖情况。结果:1、传代培养过程中,关节盘细胞表型发生改变,表现为圆形细胞减少,长梭形细胞增多,糖胺多糖表达减少;I、II型胶原蛋白表达在P2代明显增强,P3代明显减弱;Aggrecan mRNA表达在P2和P3代明显减弱(P0.01),COL I和COL II mRNA表达在P2代明显增强,P3代减弱(P0.01),COL I/COL II的比值在P1代最高(P0.01)。关节盘细胞骨架的变化表现为Actin表达增加,Tubulin和Vimentin表达在P2代最高,基因表达分析结果与荧光强度分析显示一致。2、MTT结果显示,与21%O_2组比较,4%O_2和8%O_2条件下,细胞增殖明显,在2%O_2条件下,细胞生长缓慢(P0.05)。细胞周期分析结果显示,与21%O_2组比较,2%O_2、4%O_2和8%O_2条件下,G0/G1期细胞减少,S期或G2/M期细胞增多(P0.05),细胞表现出较好的活力。细胞凋亡结果显示,各低氧组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率与对照组(21%O_2)相比无明显差异(P0.05)。3、低氧培养时,4%O_2和8%O_2条件下,细胞突起伸长,以长梭形细胞为主,I、II型胶原蛋白表达明显增强;2%O_2条件下,少量细胞变圆,I型胶原弱表达。糖胺多糖表达在各氧气浓度下未见明显变化。2%O_2条件下,COL I和Actin mRNA表达下调,Tubulin表达显著增强;4%O_2条件下,三种细胞骨架蛋白表达明显减弱(P0.05)。8%O_2条件下,关节盘细胞表型相关基因显著下调(P0.01)。结论:1、综合考虑细胞表型和细胞骨架的改变可以更好的指导组织工程种子细胞的选择。传代早期的关节盘细胞,细胞外基质表达未明显下降,肌动蛋白表达未明显上升,可作为TMJ关节盘组织工程合适的种子细胞。2、在低氧水平,关节盘细胞有更好的增殖活力和生长潜力。3、控制关节盘细胞生长的氧环境有助于维持细胞表型及细胞骨架反应性。综合考虑低氧环境对细胞表型和细胞骨架的影响,2%O_2可能成为颞下颌关节盘细胞扩增的最适氧浓度。


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