黄芪多糖促进皮肤伤口愈合的作用及其相关机制的研究

【摘要】：目的:黄芪多糖是黄中药材黄芪的重要生物活性成分,具有增强免疫力、抵抗疾病、增强体质、改善心功能、抗氧化、抗病毒和抗癌症等多种功能。临床实践发现,黄芪可以促进创伤愈合,但其作用机制尚未见报道。本文研究黄芪多糖促进皮肤创面愈合的作用及促进皮肤创面修复的作用机制。方法:第一部分:黄芪多糖的提取、纯化和黄芪多糖软膏的制备。中药材黄芪通过脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得到粗的黄芪多糖(Astragalus polysaccharin,APS),粗黄芪多糖APS经过DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析得到黄芪多糖APS2-1。采用紫外和红外光谱学分析鉴定黄芪多糖APS2-1的纯度和特征吸收峰。黄芪多糖软膏的配方为APS2-1﹕凡士林﹕SDS﹕水=2﹕60﹕2﹕65。第二部分:APS2-1促进小鼠皮肤创面愈合的研究。建立小鼠皮肤切除伤口实验动物模型,将小鼠分为APS2-1组、阴性对照组和阳性对照组,APS2-1组小鼠皮肤创面给予0.5g黄芪多糖软膏,阴性对照组小鼠皮肤创面给予0.5g不含黄芪多糖的凡士林软膏(PBS:凡士林:SDS:水=2:60:2:65),阳性对照组小鼠皮肤创面给予0.5g京万红软膏。每天给药1次,连续给药3周。观察小鼠状态和体重、创面愈合情况、创面组织病理学变化,采用ELISA法检测创面组织中TGF-β1、FGF-2、EGF和Cyclin D1的表达变化。第三部分:APS2-1对成纤维细胞的影响及其作用机制的研究。MTT法测定APS2-1对成纤维细胞CCC-HSF-1增殖的影响,Transwell法检测APS2-1对成纤维细胞CCC-HSF-1迁移的影响,流式细胞分析术检测APS2-1对成纤维细胞CCC-HSF-1细胞周期的影响,qRT-PCR法检测APS2-1对成纤维细胞CCC-HSF-1的Cyclin D1的mRNA转录水平的影响,免疫印迹法检测APS2-1对成纤维细胞CCC-HSF-1的信号通路调控蛋白NF-κB p65、IκBα和细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达水平的影响。结果:黄芪多糖的提取、纯化和黄芪多糖软膏的制备。中药材黄芪通过脱脂、水提、醇沉、脱蛋白、透析和冻干得到粗黄芪多糖APS。粗黄芪多糖APS经过DEAE-Cellulose阴离子交换柱分离纯化后被分离成两个峰,其中APS-2为酸性多糖且含量更高。APS-2经过Sephadex G-100分子筛分离纯化后被分离成两个峰,其中APS2-1分子量更大且相对含量更高。APS2-1红外光谱分析显示在4000-400cm~(-1)的波长范围内,于3390、2930、1640、1420、1160、1010、914、760 cm~(-1)等处有明显的吸收峰。APS2-1紫外光谱分析结果显示280nm和254nm未出现吸收峰,说明APS2-1中不含蛋白质、多肽、核酸成分。APS2-1促进小鼠皮肤创面愈合的研究结果显示:给药第7、14、21天APS2-1组小鼠体重显著高于阴性对照组小鼠,APS2-1组和阳性对照组小鼠体重无显著差异。给药第7、14、21天APS2-1组小鼠创面愈合率显著高于阴性对照组小鼠,APS2-1组和阳性对照组小鼠创面愈合率无显著差异。APS2-1组小鼠皮肤创面组织病理学图片显示有少量的炎性细胞浸润,出现了一些纤维母细胞,并且有一些新的血管和新的皮肤形成。阴性对照组小鼠皮肤创面组织病理学图片显示创面组织中出现了大量的炎性细胞浸润,未观察到新的皮肤和新的血管形成。阳性对照组小鼠皮肤创面组织病理学图片显示创面组织有少量的炎性细胞浸润,有一些新的血管和新的皮肤形成。APS2-1组小鼠创面组织中细胞因子TGF-β1、FGF-2、EGF和细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达均显著高于阴性对照组小鼠,APS2-1组和阳性对照组小鼠创面组织中细胞因子TGF-β1、FGF-2、EGF和细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达水平无显著差异。APS2-1对成纤维细胞的影响及其作用机制的研究结果显示:倒置显微镜下成纤维细胞CCC-HSF-1呈现梭形、放射形、三角形、多角形,未贴壁的细胞呈现圆形。在0-48小时内生长缓慢属于潜伏期。48-96小时内增长速率很快呈现指数增长属于细胞增殖的对数期。96-144小时内细胞的生长速率又降低进入细胞生长的平台期。1.0mg/l、5.0mg/l和25.0mg/l的APS2-1作用24、48、72h均能促进CCC-HSF-1增殖,最佳的作用浓度为25.0mg/l,最佳的作用时间为48小时。25.0mg/l黄芪多糖APS2-1呈时间依赖性促进CCC-HSF-1迁移。25.0mg/l的APS2-1能促进CCC-HSF-1向分裂期转变。25.0mg/l的APS2-1能上调CCC-HSF-1的Cyclin D1 mRNA的转录和Cyclin D1蛋白的表达,但下调信号通路调控蛋白NF-κB p65和IκBα的表达。结论:1.本研究建立了黄芪多糖提取和纯化的方法,并且建立了黄芪多糖紫外和红外光谱学鉴定的方法。2.APS2-1促进表皮和真皮增生、促进血管再生,加速小鼠皮肤创面愈合。3.APS2-1促进小鼠皮肤创面愈合的机制包括促进成纤维细胞增殖、迁移、细胞周期向分裂期转变、上调TGF-β1、FGF-2、EGF和细胞周期调控蛋白Cyclin D1mRNA转录和蛋白表达、下调信号通路调控蛋白NF-κB p65和IκBα的表达。