分泌蛋白及外泌体对肝癌细胞影响的蛋白质组学研究

【摘要】：肿瘤作为威胁人类健康主要疾病之一,具有较高发病率和死亡率。在了解肿瘤发生机制基础上进行有效早期诊断,理想治疗靶点和合理预后检测的研究则十分重要。肿瘤的持续生长、侵袭和转移依赖于癌细胞和/或间质细胞在肿瘤微环境中交互作用。微环境中这些细胞分泌的细胞外基质成分、活性因子、细胞外囊泡,不仅参与了炎症反应、血管淋巴生成、细胞增殖、细胞转移侵袭、免疫抑制、上皮-间质转化等过程,也是肿瘤潜在标记物和治疗药物靶点的丰富来源。肝细胞肝癌作为慢性炎症、血管生成、微环境等相互作用的最终结果,探讨微环境中分泌组分在肝癌发生中的作用,具有一定科学意义和临床价值。肝脏特异性间质细胞-肝星状细胞,以及肝实质肿瘤细胞在微环境中的作用,即这些细胞释放的产物如分泌蛋白、外泌体等对肿瘤的影响,尚不完全清楚。本研究在利用蛋白质组技术分析其分泌产物组成基础上,探讨分泌蛋白、外泌体对肿瘤细胞增殖、迁移的影响以及在肿瘤药物抵抗中的作用,并表征影响后肿瘤细胞蛋白表达差异,通过生物信息学结合在线数据库进行注释和分析,为揭示肿瘤微环境动态组成以及在肿瘤发生中的分子机制,提供基础研究数据和参考。本研究采用人肝癌细胞系Huh7,SMMC-7721以及人活化肝星状细胞系LX-2,分别通过超滤法提取其分泌蛋白、超速离心法和试剂盒提取其外泌体;在电镜和Western blot鉴定外泌体基础上,利用双向电泳技术表征分泌蛋白及外泌体蛋白质组成。通过CCK-8法观察细胞活力,划痕实验和Transwell小室法观察细胞迁移能力,探究分泌蛋白、外泌体对肿瘤细胞的影响以及在索拉菲尼耐药中的作用。利用双向电泳技术表征分泌蛋白、外泌体影响肿瘤细胞的表达差异蛋白,并经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定。最后通过生物信息学方法以及在线数据库TCGA和GEO,整合分析、注释分泌蛋白及外泌体蛋白质及其影响后的肿瘤差异蛋白之间的关系。结果显示,来源于Huh7、SMMC-7721、LX-2细胞的分泌蛋白和外泌体对肿瘤细胞的增殖和迁移能力有一定影响(P0.05);肿瘤细胞来源的外泌体能促使Huh7、SMMC-7721细胞对索拉菲尼产生一定的耐药性(P0.05);经蛋白质组表征,肿瘤细胞Huh7、SMMC-7721和肝星状细胞LX-2来源的分泌蛋白和外泌体具有不同的蛋白表达谱,分泌蛋白成分多源于外泌体;不同方法提取外泌体表达谱不同;LX-2分泌蛋白与其引起肿瘤细胞表达差异蛋白共同参与应激反应,部分蛋白参与NF-kB通路以及内质网中的蛋白质过程并与肿瘤发生及不良预后显著相关(P0.01)。微环境中外泌体与其干预肿瘤细胞差异表达蛋白共同参与了多种生物过程,部分蛋白与肿瘤发生及不良预后显著相关(P0.01),并参与了肿瘤细胞对索拉菲尼的耐药过程。综上所述,本研究结论如下:肿瘤微环境中活化肝星状细胞与肿瘤细胞分泌蛋白及外泌体表达谱不同,分泌蛋白大多来源于外泌体;肿瘤微环境中分泌蛋白和外泌体对肿瘤的增殖和迁移,以及肿瘤来源外泌体对肿瘤的耐药性有一定程度影响,并能改变肿瘤细胞蛋白的表达水平。差异蛋白参与了部分应激途径,如内质网蛋白失衡、糖酵解以及PI3K-Akt信号通路、Rho依赖的细胞运动信号通路来促进肿瘤的增殖与迁移;RAN、CAP1、HSPA5、ANXA5、DNM1L、PSMA6、PYGB、SGTA蛋白与肝细胞肝癌的发生、不良预后显著相关;ANXA5、YWHAZ、蛋白酶体等与索拉菲尼耐药有关。