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聚合物添加剂对环烯烃共聚物芯片电泳分析性能的影响及其应用

李红丽  
【摘要】:环烯烃共聚物(COC)化学性质稳定,光学透明,耐极性有机溶剂和强酸、强碱,易加工,可批量生产,是制作微流控芯片的理想材料。但其与其它常用的制作芯片的聚合物材料一样,表面呈强疏水性,当用于微流控芯片电泳(MCE)分析蛋白质等生物大分子时,样品的物理吸附会导致样品区带展宽,表面电荷不均一,电渗流不稳定,进而影响分析效率,导致分析结果不重复。MCE分析时间短,耗样量少,易集成化,是实现分析物快速分离检测的理想技术。但是,用于MCE的分离通道相对较短,对于复杂生物样品的分离分析依然存在挑战。且样品通道和分离通道相通,储液池间的液位差引起的压力流会引发进样量难以控制、样品区带展宽等问题,影响定量准确性和分离效率,对实验操作者专业技术要求高。而且芯片电泳不能实现对复杂生物样品中蛋白质的特异性分离,因此进行MCE分析前样品中蛋白质的特异性预提取很有必要。此外,MCE联用激光诱导荧光检测(LIF)方法分析蛋白质等自身无荧光或弱荧光的分析物时,必须进行荧光衍生,而大多衍生反应的时间远远超过MCE分离的时间,因而发展一种快速、高效的荧光标记方法尤为必要。为了解决以上问题,本论文在前人工作的基础上,致力于探索简单、低成本提高COC-MCE分析性能、耐用性和实用性的新方法,发展快速分析蛋白质的新途径。本论文的主要创新工作包括:(1)以麻黄碱和伪麻黄碱为模型分析物,系统研究了中性羟丙基纤维素(HPC)和阴离子羧甲基纤维素钠(CMC)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)作多功能缓冲添加剂对电泳行为的影响。(2)系统研究了水溶性聚合物羟乙基纤维素(HEC)、聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PA)、HPC和PSS与COC芯片表面的相互作用及其对蛋白质电泳分析的影响。(3)利用电场在COC芯片微通道快速、原位制备了用于高效MCE分析的壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)固态水凝胶。通过电场驱动乙酸将使用过的水凝胶溶解,经水润洗通道后可以重新制备水凝胶。此方法用于人血清样品中转铁蛋白和乳铁蛋白的灵敏检测。(4)通过适当提高温度实现了蛋白质的快速衍生,并用于MCE-激光诱导荧光检测(LIF)分析,一个样品从衍生到分离、检测完成仅需5 min。此方法用于大肠杆菌裂解液中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)纯化过程的监测。(5)成功制备了磁性复合纳米材料Fe_3O_4@PDA@Ni-MOF,用于HeLa细胞裂解液中组氨酸标记的绿色荧光蛋白(His-GFP)的特异性提取,并用MCE-LIF检测方法实现了His-GFP灵敏检测。本论文共分为六章:第一章:对MCE分析系统作了详细介绍。包括MCE进样技术、分离模式及常用检测方法,MCE中常见问题,提高MCE分析性能的方法,聚合物在MCE中的应用及MCE在生化分析中的应用。第二章:以麻黄碱(E)和伪麻黄碱(PE)为分析物,研究了中性聚合物HPC、阴离子聚合物CMC和PSS作多功能添加剂时对其电泳行为的影响。HPC、CMC和PSS均会使COC表面亲水性增加。HPC作缓冲添加剂时分析物向阳极迁移,CMC或PSS作缓冲添加剂时分析物向阴极迁移。以硼砂作为缓冲,HPC或CMC作缓冲添加剂时,溶液pH和聚合物浓度对E和PE分离度均有较大影响。0.3%HPC(pH 9.5)或0.3%CMC(pH 9.0)作添加剂时E和PE均能实现基线分离(Rs分别是1.2和1.1)。PSS作缓冲添加剂时,E和PE不能分离,只有加入β-环糊精后E和PE才能实现分离,而PSS添加量和运行缓冲溶液pH对分析物迁移时间和塔板数有较大影响。结果证实,三种聚合物作缓冲添加剂分离E和PE时,同时起到了表面改性、粘度调节和电渗流调控的作用,HPC和CMC对E和PE有区分的作用,而PSS对两者并无区分作用。第三章:通过测量COC芯片与水溶性聚合物HPC、HEC、PSS、PEO、PA和PVP在25℃和80℃加热条件下相互作用后芯片表面的接触角,发现除HPC外,加热(80℃)可以增强聚合物与COC的相互作用,六种聚合物均能使COC表面亲水性增加。PSS处理后的COC芯片与空白COC芯片电渗流相差不大,其它五种聚合物均能有效抑制电渗流。以HSA(pI 4.7)和溶菌酶(pI 11.1)为模型蛋白,通过测定流动电势研究了聚合物对COC芯片微通道表面蛋白质非特异吸附的抑制能力,结果证明PA和PSS抑制蛋白质非特异吸附效果较差,PEO、PVP、HPC和HEC能有效抑制蛋白质在COC表面的非特异吸附。聚合物作为缓冲添加剂分离蛋白质和多肽时,PSS和PA的实验结果重复性差,PVP和HPC的疏水基团与蛋白质的相互作用降低了蛋白质和多肽的分离效果。HEC和PEO作为缓冲添加剂对芯片有很好的改性作用,可以有效抑制蛋白质的非特异吸附,对分析物有很好的分离效果。以HCE作缓冲添加剂,有效分离距离1 cm,15 s内即可实现EGFP三种亚型的基线分离,蛋白质的理论塔板数可以达到1.0×10~6/m以上。第四章:使用MCE装置提供的电场,建立了一种在微通道中快速、原位制备可替换的用于高效MCE分析的CS/β-GP固态水凝胶的方法。此方法具有制备速度快,可原位制备,且得到的水凝胶界面均匀整齐等优势。施加2000 V电压,15 s即可在COC十字芯片的分离通道制备CS/β-GP固态水凝胶。分离通道中水凝胶的存在能有效消除液位差引起的压力流,得到较窄的样品区带(105μm)。CS/β-GP水凝胶对有机溶剂兼容性好,缓冲中有机溶剂(甲醇、乙腈、DMSO、乙醇和异丙醇)含量高达90%时,水凝胶依然稳定。以FITC标记的HeLa细胞裂解液为样品进行电泳分离,CS/β-GP水凝胶连续使用200次,其分离效率几乎没有发生改变,迁移时间和峰面积RSDs分别低于4.7和3.9%。使用过的CS/β-GP水凝胶可通过电场驱动乙酸将其溶解,然后水润洗通道之后即可制备新的水凝胶。此方法用于人血清样品中乳铁蛋白和转铁蛋白的检测,加标回收率在90-104.9%范围内。第五章:建立了一种通过适当提高温度来实现蛋白质快速荧光衍生的方法,并考察了其COC MCE-LIF检测的适用性。以重组蛋白A为模型蛋白,比较了五种荧光染料(Alexa Fluor 488,NBD-F,NBD-Cl,FITC,Chromeo~(TM) P503)对蛋白质的标记效率,FITC标记效率最高,但室温条件下反应时间(12 h)远远超过MCE分离的时间(120 s),实验发现,通过提高FITC与蛋白质的反应温度至95℃,衍生时间可缩短至3 min,有效加快了样品处理速度。胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂95℃反应3 min的标记效率比室温反应12 h的标记效率更高。与SDS-PAGE方法相比,COC MCE-LIF检测方法分析有效缩短了分析时间,5min即可完成一个样品的衍生及分离、检测。此方法成功用于大肠杆菌裂解液中EGFP纯化过程的监测。第六章:通过溶剂热法制备了Fe_3O_4,随后在碱性条件下在其表面均匀包裹了一层聚多巴胺(PDA),而后以PDA包覆的Fe_3O_4纳米颗粒(Fe_3O_4@PDA)为核,以对苯二甲酸为配体,Ni(NO_3)_2·6H_2O为金属源,DMF为溶剂,利用溶剂热法在120℃反应10 h,成功制备了Fe_3O_4@PDA@Ni-MOF磁性复合纳米材料。利用TEM和FT-IR对此复合材料进行表征,结合磁滞回线,证明此材料成功合成。与Fe_3O_4相比,此材料在水溶液中具有更好的分散能力和稳定性,且其具有超顺磁性,在外界磁场存在下1 min即可从水溶液中分离。其对His-蛋白质特异性提取能力强。实验系统研究了此材料对His-GFP吸附动力学过程及材料的重复利用效率,此材料循环利用五次后,其吸附效率无明显变化。将此材料用于HeLa细胞裂解液中His-GFP特异性提取,结合MCE-LIF实现了His–GFP的灵敏检测。


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