富血小板血浆影响大鼠卵巢组织冷冻复苏、功能恢复及血管重建的研究

【摘要】：研究背景:近年来,女性恶性肿瘤呈现发病率增加和低龄化趋势,随着癌症治愈率的提升,癌症治愈后的女性更多关注到自身的生育能力和生活质量,然而放化疗对卵巢内分泌及生殖功能造成了不可逆的损伤。卵巢组织冷冻保存及移植技术是不延误癌症治疗时机和目前唯一适合青春期前女性生育力保存的方法。然而,限制卵巢组织移植后成活的主要原因为卵巢组织的冷冻损伤和移植后的缺血性损伤,因此,减少卵巢组织冷冻损伤及移植后缺血性损伤是提高卵巢组织移植成功率的关键措施。富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)中含有丰富的促进组织生长、愈合和再生的细胞因子和富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF),能够加速损伤组织的修复过程,且来源方便、安全,在运动医学、美容医学领域已有充分的研究及临床应用,在生殖医学中,PRP在薄型子宫内膜和原发性卵巢功能不全方面的研究已取得较好的成果,将PRP用于卵巢组织冷冻复苏及移植过程尚无相关研究,但PRP的特点及在其它领域的研究结果提示:PRP在卵巢组织移植方面具有重要的研究价值。研究目的:本研究旨在通过动物研究明确PRP对卵巢组织冷冻复苏的影响,寻找添加PRP后卵巢组织冷冻复苏的最佳冷冻液孵育时间;研究PRP对卵巢组织冷冻复苏效果、生殖内分泌功能及血管重建的影响和可能机制,为PRP在卵巢组织移植方面的临床研究和应用提供相应的实验依据和启发。研究方法:将大鼠随机分为:实验组(冷冻液及复苏液中含有PRP)、阴性对照组(冷冻液及复苏液中不含PRP)以及新鲜对照组(卵巢组织不进行冷冻复苏)。按照卵巢组织在冷冻液里的孵育时间,将PRP干预组随机分为5个亚组:5 min组、10 min组、15 min组、20 min组、30 min组,每组8只大鼠。通过对PRP对卵巢组织冷冻复苏的影响、PRP对卵巢组织自体移植后生殖内分泌功能恢复的影响、PRP影响卵巢组织移植的转录组学研究、PRP影响卵巢组织移植后血供重建及可能的机制四章节内容的研究,分别探讨实验组与对照组对卵巢组织冷冻复苏效果、生殖内分泌功能及血管重建的影响和可能机制,以及添加PRP后冷冻液孵育的最佳时间,采用组织学、免疫荧光、免疫组化、ELISA、RT-PCR及Western Blot分析等方法,对各组卵巢组织冷冻复苏及移植后单位视野下原始卵泡数、初级卵泡数、次级卵泡数、单位视野下血管数、卵巢组织中VEGF、PDGF-B、HIF-1αm RNA和蛋白表达、大鼠血清AMH和E2浓度等指标进行统计学分析。主要结果:冷冻复苏后,实验组卵巢组织单位视野原始卵泡数高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);实验组中,冷冻液孵育时间5 min、10min、15 min、20 min、30 min组,组间相比,卵巢组织冷冻复苏后各组之间初级卵泡、次级卵泡数量未见统计学差异(P0.05)。冷冻液孵育时间5 min及30 min时,卵巢组织冷冻复苏后及移植3周后,卵巢组织中VEGF、PDGF-B及HIF-1α的m RNA和蛋白表达低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);卵巢组织移植3周后,冷冻液孵育时间5 min及30 min组的大鼠血清AMH及E2浓度低于10-20 min和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);卵巢组织移植后第1周和第2周,实验组VEGF m RNA表达水平高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05),PDGF、HIF-1αm RNA两组无统计学差异;卵巢移植后第3周,实验组VEGF、PDGF、HIF-1αm RNA和蛋白表达水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。实验结论:以上研究主要表明,冷冻-复苏液中添加100μL/m L浓度的PRP能够使大鼠卵巢组织在冷冻复苏、移植后血管重建及生殖内分泌功能恢复方面获益;PRP对大鼠卵巢组织的冷冻复苏后移植成功的促进作用与卵巢组织在冷冻液中的孵育时间具有相关性,冷冻液孵育时间过短或过长均不利于卵巢组织成功移植,大鼠卵巢组织在冷冻液中孵育时间为5 min时,卵巢组织的冷冻复苏效果不佳,而孵育10-20 min时,有利于卵巢组织玻璃化冷冻复苏及移植后血管重建,孵育30 min时,实验组效果虽优于阴性对照组,但较孵育10-20min弱;通过对大鼠卵巢组织样本的测序分析及KEGG富集分析,提示PRP在促进大鼠卵巢组织成功移植方面的作用与HIF-α信号通路及促进VEGF的表达具有相关性;PRP促进大鼠卵巢组织移植后血管重建及生殖内分泌功能恢复方面的机制可能与PRP促进了解冻移植后大鼠卵巢组织中VEGF、PDGF-B及HIF-1α因子的表达有关,但具体机制仍需进一步研究明确。