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Neotyphodium gansuense离体麦角碱的检测和N.lolii麦角碱基因的测序

高嘉卉  
【摘要】:我国北方天然草原主要的烈性毒草—醉马草(Achnatherum inebrians)的毒性与内生真菌的侵染有关,受侵染的植物体内产生大量的麦角新碱(Ergonovine)和麦角酰胺(Lysergic acid amide)。我国学者从醉马草中分离并正式发表了一内生真菌新种Neotyphodium gansuense,但对其在人工培养条件下产生麦角碱的能力尚未见报道。另一方面,在麦角碱的生物合成途径方面,以数种麦角菌(Claviceps spp)为材料,已明确其生物合成途径中的大部分步骤,发现并克隆了起关键作用的dmaW基因和cpdl基因。本研究以N.gansuense的12个菌株以及Neotyphodium lolii(Nl)为材料,测定了其在四种培养基中,用高效液相色谱(HPLC)检测了其在人工培养条件下,产生麦角新碱和麦角酰胺的能力。进而以N.lolii的普通菌株AR1和突变体菌株Lp19为模式,对dmaW基因全序列进行了克隆并测序比较。取得的主要结果如下: 供试的4种培养基中,M102和PDB更适合N.gansuense菌丝体的生长,其中M102优于PDB。而培养基SM和M104更适合N.gansuense产碱,其中M104优于SM。 在菌丝体生长培养基M102和PDB中培养4周后,各参试菌株的生物量差异显著(P0.05),其中以菌株NgSla1和NgL112生长最为迅速,其生物量分别为68.25和65.56 mg/ml;以Ng菌株L141和NgL221生长最为缓慢,其生物量分别仅为12.305和16.04 mg/ml,仅分别相当于菌株NgSla1和NgL112生物量的18.03%-27.57%和18.77%-24.47%。 各参试菌株在SM和M104产碱培养基中产麦角酰胺和麦角新碱能力均随培养时间的延长而增加。各菌株间产麦角酰胺和麦角新碱能力存在差异。在M104培养基中培养至第八周,产生麦角酰胺浓度最高的是菌株NgL151(27.6ppm),是浓度最低的菌株NgL141(5.46ppm)的5倍,产生麦角新碱浓度最高的是菌株NgL221(32.55ppm),是浓度最低的菌株NgL141(3.25ppm)的10倍。各菌株产生麦角酰胺和麦角新碱的平均浓度分别为15.8和12.8ppm,是在SM培养基中的(平均值分别为10.6和3.2ppm)1.2和4倍。 菌株NgL161和N.lolii在产碱培养基SM和M104中均未检测到麦角酰胺和麦角新碱。该结果为培育不产麦角碱的禾草共生体提供了可能,同时也为研究麦角碱在N.gansuense中的生物合成途径提供了良好的材料。 对N.lolii的两个不同菌株AR1和Lp19的dmaW整个基因序列进行了克隆并测序,结果表明绝大多数序列均完全相同,只有4个碱基对的PCR误差。 综上所述,本试验首次明确了N.gansuense的体外产碱特性。动态及菌系间差异,N.lolii麦角碱生物合成途径中dmaW基因的序列及其差异。为进一步研究利用N.gansuense-醉马草共生体奠定了基础。


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