小麦抗白粉病基因遗传图谱构建及抗病相关基因的克隆

【摘要】： 由禾布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria graminis(DC．)E．O．Speer f sp．tritici)引起的小麦白粉病，是世界范围的重要小麦病害。利用抗病品种是防治该病最为经济、有效和环境安全的方法。与抗病基因紧密连锁的分子标记不仅便于抗病基因鉴定和作图，而且可以在育种中进行抗病品种／系的标记辅助选择(MAS)分子标记辅助选择将极大地提高基因累加效率，加速育种进程。植物抗病基因克隆的研究对于抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。运用抗病基因类似物法(RGA法)克隆分离目的基因或寻找新的抗病基因是一条最经济、快捷的途径。 本研究对小麦抗白粉病基因载体品种／系进行了抗性鉴定和遗传分析。采用SSR、STS、SRAP和RGA等技术，鉴定了与小麦抗白粉病基因Pm4b紧密连锁的分子标记，并构建了PmZB90基因的高密遗传图谱。同时运用RGA方法克隆了一些抗病基因同源片段，进一步做了RT-PCR分析和TAIL-PCR序列延伸，为获得全长抗病基因和研究小麦抗病机理奠定基础。 主要研究结果如下： 1．对小麦不同Pm基因载体品种／系的成株期抗性鉴定结果表明，29个已知单基因或多基因载体品种中，表现免疫的有6个，所携带基因为Pm4b、Pm13、Pm20、Pm21、Pm23和Pm24；表现高抗和中抗的基因有Pm4a、Pm6、Pm17、Pm22、Pm5a+6和Pm33。这些抗性好的基因应该小麦抗病育种计划中充分利用。 2．位于2A染色体长臂上的小麦抗白粉病基因Pm4b是目前应用广泛的有效抗病基因。本研究运用集群分离分析法鉴定了四个与Pm4b基因连锁的标记。用240对引物组合筛选感抗池，有20对引物组合能在感抗池之间扩增出多态性。进一步用157株F_2分离群体验证标记的连锁性，最终获得了两个扩增带型稳定，与Pm4b基因遗传距离较近的标记Me8／Em7-220和Me12／Em7-205。STS标记STS-241距Pm4b基因仅4.9cM。另外，还分析了位于2A染色体长臂的8个SSR标记，Xgwm382与Pm4b基因显性分离，距Pm4b基因11.8cM。 分析这四个标记对Pm4b基因的专一性，发现Xgwm382-125bp对Pm4基因位点特异。显性标记STS-241和Me8／Em7-220能够区分Pm4b和Pm4a，可以被应用于分子标记辅助选择，有助于Pm4b基因的高效利用。为抗病基因的快速、有效和合理利用奠定基础。 3．小麦农家品种ZB90是一个有效的广谱抗白粉病材料。苗期和成株期抗性鉴定表明，其白粉病抗性由显性单基因控制，暂命名为PmZB90。从位于不同染色体上的53个SSR标记中筛选出3个标记Xgwm311、Xgwm382和Xgwm312，对144株F_2分离群体进行连锁性分析。根据遗传距离将PmZB90定位到小麦染色体2A长臂。结合我们鉴定的STS标记STS-470、RGA标记RGA-1102、SRAP标记Me5／Em5-650和Me8／Em16-600构建了PmZB90基因的高密遗传图谱。PmZB90位点与7个标记的顺序为：Me5／Em5-650—RGA-1102—PmZB90—Xgwm382—Xgwm311—Me8／Em1l6-600—STS-470—Xgwm312。这7个区间的遗传距离依次为：3.7cM、9.2cM、2.9cM、4.5cM、2.3cM、20.8cM、49.6cM。与小麦染色体2AL上已构建的遗传图谱顺序一致。 根据材料来源、抗病基因的染色体定位结果及PmZB90同其他位于2AL上的基因之间的关系分析，确认该基因为一个新的小麦抗白粉病基因，可能同PmDR147基因等位。小麦抗白粉病新基因PmZB90的鉴定和高密遗传图谱构建，能够弥补现有抗源材料的不足，为小麦抗白粉病育种提供新的优良抗病基因。 4．本研究根据抗病基因保守结构域设计简并性引物，对小麦抗白粉病基因的一些载体品种／系进行扩增。从小麦VPM和ZB90中克隆了一些RGA片段，对其进行序列分析和功能预测，发现有6个DNA片段属于抗病基因同源序列，并着重分析了从小麦VPM中克隆的RGA1231和从ZB90中克隆的RGA1102片段。 运用RT-PCR技术，研究了小麦白粉菌诱导后Rc955基因的表达。Rc955受白粉菌的诱导，在一定时间内表达量会有所增加，但变化不大，可能为组成型表达。 根据RGA序列RGA1102在两端设计了3对嵌套式特异引物，利用TAIL-PCR技术将RGA1102成功向5’端延伸799bp，向3’端延伸281bp，序列延伸后的总长度为2182bp。序列分析表明所获得的序列包含一个全长的编码序列。以上研究为PmZB90基因的分离克隆和功能研究奠定了基础。