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重组合异种骨复合VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对兔非创伤性股骨头坏死修复的实验研究

张辉  
【摘要】: 目的:1.探讨体外骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离、培养和鉴定的方法。2.探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染MSCs的表达。3.研究重组合异种骨(RBX)复合VEGF基因转染的MSCs对非创伤性股骨头坏死(nontraumaticosteonecrosis of femoral head.NONFH)修复的治疗疗效。 方法:1.MSCs取自4-6月龄2.5-3.5kg的青紫兰兔,用贴壁培养筛选法结合密度梯度离心法进行分离培养后行细胞表型的鉴定。2.采用脂质体Lipofectin转染法将hVEGF-165基因转染进入骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化S-P法检测转染细胞外源性hVEGF165基因瞬时表达与稳定表达。3.用局部液氮冷冻法建立兔NONFH模型24只(共48髋),随机分为治疗组和对照组,各24髋。治疗组股骨头坏死区植入复合VEGF基因转染骨髓间充质干细胞的重组合异种骨,对照组仅植入重组合异种骨,行X线大体标本,组织病理检查及股骨骨密度和矿物质含量检查,所得数据输入SPSS13.0软件进行统计分析,比较两组组间及组内的差异是否具有统计学意义。 结果:1.本实验分离培养的MSCS形态学特征明显,免疫细胞化学方法鉴定结果为CD44、CD90阳性表达,CD34阴性表达。2.基因转染后MSCs生长增殖良好,基因转染后72h和筛选培养4周后,RT-PCR、Western Blot和免疫组化都能检测到VEGF基因的转录及表达,而空载体转染组未见其转录及表达。3.在X线上,两组第2周,相差不大,坏死区密度均较低;第6周时治疗组坏死区出现骨小梁结构,新骨形成增加,骨密度较对照组高;第12周时治疗组股骨头形态规则,密度均匀,接近于正常兔股骨头密度,对照组股骨头坏死区有囊状低密度区。骨密度和矿物质含量测定上,2周时两组比较无明显差别,6周和12周时两组差异有显著差异性(p<0.01)。在组织学上,2周时所有兔股骨头骨细胞、软骨细胞、骨髓细胞完全坏死,骨小梁完整;6周时治疗组骨细胞及微毛细血管明显多于对照组;12周治疗组新生骨组织修复达软骨下,对照组植入骨块仍有少量未吸收。 结论:1.采用梯度密度离心法分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的MSCs,并能大量增殖;2.通过脂质体介导能成功的将hVEGF165基因转入MSCs,使其在mRNA和蛋白质水平均有VEGF的稳定表达。3.重组合异种骨复合VEGF基因转染骨髓间充质干细胞不仅能促进毛细血管的生成,而且有明显的成骨诱导作用,能有效促进非创伤性股骨头坏死的修复。


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