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大鼠β-防御素-2的重组表达及抗菌活性检测

李爱娟  
【摘要】: 感染性疾病从古至今都是医学研究中极为重要的课题。虽然抗生素在防治微生物感染中发挥了巨大的作用,但由于长期滥用抗菌药物,细菌耐药性问题已经成为困扰医学界的一大难题,解决细菌耐药性问题成为当务之急,因此,寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物具有非常重要的现实意义。抗菌肽作为生物机体内天然免疫系统的重要组成部分,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤等多种生物学活性,并且由于它独特的抗菌机制使得病原微生物不易产生耐药性。因此,具有作为新型抗生素的潜在应用前景。 目的:构建大鼠β-防御素-2(rBD2)的真核表达载体pCAGG-rBD2,转染小鼠纤维母细胞(L929),检测目的基因在转染细胞中的表达,初步测定表达产物的体外抗菌活性,为解决细菌耐药性问题提供理论和实验基础。 方法:以大鼠肺组织总RNA为模板,采用RT-PCR的方法获得β-防御素-2基因cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体并构建含有目的片段的真核表达载体pCAGG-rBD2,经脂质体介导转染L929细胞,用RT-PCR和Western blotting等方法检测目的基因表达情况;用Kirby-Baue纸片扩散法检测其生物学活性。 结果:RT-PCR扩增出约230bp的片段,将其连接到克隆载体后,测序分析表明与Genebank中rBD2 cDNA序列一致,为rBD2编码全序列;所构建的真核表达载体pCAGG-rBD2经酶切鉴定并测序,结果表明其核苷酸序列及连接方向正确,可进行转染;以转染pCAGG-rBD2的L929细胞总RNA为模板,用RT-PCR扩增出特异条带;Western blotting检测转染细胞的培养液呈阳性,表明构建的真核表达载体pCAGG-rBD2转染L929细胞后,能正确表达大鼠β-防御素-2;K-B纸片法检测结果显示转染pCAGG-rBD2细胞的培养液对金黄色葡萄球菌具有杀灭作用。 结论:获取并克隆了rBD2基因,成功构建了rBD2的真核表达载体pCAGG-rBD2,转染pCAGG-rBD2的L929细胞能高效表达rBD2,转染细胞的培养液具有杀灭金黄色葡萄球菌的生物活性。


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