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TGF-β1/TAK1信号转导通路在肾间质纤维化中的作用及福辛普利对其影响的实验研究

卢守燕  
【摘要】: 肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是终末期肾病的一个显著特征,是进行性肾脏损害的主要表现。有研究表明,细胞因子TGFβ1在实验性肾病和人的肾脏疾病纤维化过程中起着关键作用,拮抗细胞因子的不良作用已成为防治肾小管间质纤维化进展的重要环节。TGFβ1可以刺激基因编码的细胞外基质包括Ⅰ型胶原纤维的表达,但TGFβ1的信号转导机制仍然没有完全被认识清楚,因此,加强对肾小管间质纤维化相关细胞因子通路的研究是了解肾小管间质纤维化机制,探索新的治疗方法和手段的重要途径。转化生长因子β激活激酶(TGF-activated kinase 1, TAKI)是最早被发现的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族成员之一,可以被不同的刺激物激活参与不同的信号通路,其中包括TGFβ1。在肾间质纤维化过程中的不同阶段,炎症因子和肾小管间质纤维化相关细胞因子的释放、细胞外基质(extra-cellular matrix, ECM)的产生、肾固有细胞的活化及表型转换,可能有不同的TGFβ1/TAK1信号通路参与。由于肾间质纤维化的发病机制较为复杂,目前其研究成果尚处于起始阶段,这方面的研究报道较少,故在本研究中,我们将采用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠模型及体外细胞实验,进一步研究TAKl在肾间质纤维化中的作用,为进一步揭示肾小管间质纤维化的生物学机制提供理论依据。 福辛普利(fosinopril, FOS)是一种血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI),能使血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)生成减少,抑制激肽酶使缓激肽降解减少,已被大量肾脏疾病动物模型及临床研究证实,其具有延缓肾功能恶化、保护肾脏的作用,但其对肾小管间质纤维化相关信号通路的影响和作用机制尚不十分清楚。为进一步探讨福辛普利防治肾小管间质纤维化的作用机理,在本研究中,我们从现代药理学角度分别就动物实验及细胞试验进行了研究,总结探寻福辛普利对TGF-β/TAKl信号转导通路在UUO致肾小管间质纤维化大鼠中的可能作用机理,为临床RIF的治疗提供理论及实验依据。 第一部分福辛普利对肾间质纤维化大鼠TAK1表达的影响 目的:观察福辛普利对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏转化生长因子β激活激酶(TAK1)表达的影响,及其对肾间质纤维化(RIF)的保护作用,为进一步开展防治肾间质纤维化研究提供实验依据。 方法:采用单侧输尿管结扎术致RIF大鼠模型,将72只SPF级雄性Wistar大鼠按随机数字表分为三组,假手术组、UUO模型组及福辛普利治疗组,每组24只,治疗组于术后2 d给予福辛普利10 mg/(kg·d)灌胃,假手术组与模型组每天给予等量生理盐水灌胃。各组分别于术后7、14、21 d处死8只大鼠,采用HE及Masson染色观察梗阻侧肾脏病理变化,采用原位杂交检测肾脏TAK1的定位表达,Western-bloting检测TAK1蛋白的定量表达,实时荧光定量PCR (RT-PCR)技术观察TAKl mRNA的表达。 结果: 1)组织病理学染色观察,与假手术组相比,模型组大鼠梗阻侧肾组织出现肾小管上皮细胞的空泡变性、坏死,部分肾小管萎缩、管腔扩张,肾间质水肿、增宽,并有炎性细胞浸润和纤维化,胶原纤维增多。肾小管间质损伤指数明显高于同期假手术组及福辛普利治疗组(P0.05),且逐渐呈现升高趋势,说明肾间质纤维化模型制备成功。 2)原位杂交结果显示,TAKl mRNA的表达,假手术组仅在肾小管上皮细胞的细胞核内有棕黄色颗粒状阳性染色;模型组高表达于肾小管上皮细胞及成纤维细胞,在肾间质基质中呈弥漫棕黄色条索状分布,随着梗阻时间的延长,表达逐渐下降(P0.05);福辛普利治疗组较同期模型组表达明显下降,但仍高于假手术组,呈散在棕黄色细线样分布(P0.05)。 3) Western-bloting结果显示,TAKl蛋白在假手术组有少量基础表达;与假手术组相比,模型组的表达量于UUO术后7 d明显升高,以后表达逐渐下降(P0.05);经福辛普利治疗后,TAKl蛋白表达下降,但仍高于同期假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。 4)实时荧光定量PCR结果显示,假手术组TAKl mRNA有少量基础表达;与假手术组相比,模型组的表达量于UUO术后7 d明显升高,随着梗阻时间的延长,表达逐渐下降(P0.05);与模型组相比,福辛普利治疗组的表达量明显降低,但仍高于同期假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:TGF-β/TAKl信号转导通路分子家族在UUO致肾小管间质纤维化大鼠模型中早、中、晚期的表达并不相同,呈现出先增高后降低的趋势,说明在肾间质纤维化过程中激活该通路的细胞因子以及调节因素,对肾间质纤维化病理过程的形成起了重要作用;福辛普利可能通过下调TAK1的表达,从而减轻UUO术后肾组织间质纤维化的病程进展。 第二部分福辛普利对LPS诱导的人肾小管上皮细胞TAK1表达的影响 目的:探讨福辛普利(FOS)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖及对转化生长因子β激活激酶(TAK1)表达的影响及其可能作用机制。 方法:体外培养正常HK-2细胞,分为4组:对照组(Ctrl)、LPS诱导组(10ug/L)、FOS组(FOS 1×106mol/L)、LPS+FOS组(LPS 10ug/L+FOS 1×106 mol/L)。细胞培养12、24、48h,以甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附(ELISA)法观察细胞上清纤维粘连蛋白(FN)变化,Western-blotting法检测TAK1、FN蛋白表达,实时荧光定量PCR检测TAK1 mRNA的含量。结果:LPS诱导组细胞的增殖水平、细胞胞浆中FN的含量均显著增高,且自12h开始TAK1蛋白及mRNA表达水平上调,较对照组比较差异有统计学意义(P0.01,P0.05),FOS组及LPS+FOS组细胞增殖、FN的含量及TAK1的表达与同时间点LPS组比较显著下调(P0.01)。 结论:LPS可诱导HK-2增殖且分泌FN增加,FOS可抑制LPS诱导的HK-2增殖及促进FN的降解,对细胞增殖过程中TAK1蛋白及mRNA的表达有下调作用,其作用机制可能与抑制TAKl信号传导通路有关。


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