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大容量人源肝癌核糖体展示单链抗体库的构建

王溪桥  
【摘要】: 目的: 构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。 方法: 分别收集40例人新鲜外周血,各2ml(肝癌患者10名、健康成人26名、2岁儿童2名、新生儿2名),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consist region of light chain, CK)。采用改进的重叠延伸PCR (SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-Vector转化E.coli DH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。 结果: 1、构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库。 2、经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。 结论: 采用改进的重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。


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